AULA BIOTECNOLOGIA 12 - Purificação de proteínas recombinantes

Então vamos começar a nossa aula de purificação das proteínas recombinantes primeiro aviso eu falei que ia trazer o trabalho extra essa semana mas não consegui montar o trabalho extra ainda então vai ficar para semana que vem tá mas eu aviso para vocês quando colocar no Drive certinho Não se preocupem vai ter esse trabalho extra já prometi que vai ter Então vai ter isso eu garanto tá só não vai ser agora Podem ficar tranquilos Ainda bem que tá gravado Pois é pode me cobrar lá no YouTube ainda né também como eu fugir tenho provas três provas

contra mim Então vamos lá para Purificação das proteínas já combinantes a gente tá desde do início do ano né Março desde março nesse processo que é gerar um organismo ogm geneticamente modificado para que ele Produza uma proteína de interesse para gente toma proteína que tem valor Comercial Ou que tenha valor terapêutico né a gente tá usando o exemplo da insulina e ao longo do nosso curso Então a insulina Seria uma boa candidata né para essa etapa final que é a purificação da proteína recombinante Nesse caso a insulina Então vamos a ela primeiro que as proteínas

são valiosas né de um ponto de vista terapêutico e do ponto de vista econômico muitas proteínas são muito importantes para o tratamento de Diversas doenças Então a gente tem os anticorpos que foram utilizados durante a crise do covid que as pessoas acamadas que estavam em UTI a gente injetávamos anticorpos 2 para tentar melhorar o quadro geral da doença a gente tem proteínas que são muito importantes para quem por exemplo sofre de anemia a gente tem que eritropoetina que é uma proteína responsável por produzir mais hemácias né o sinal que sinaliza para suas Células tronco do

sangue para produzirem mais hemácia então para quem tem anemia é uma proteína super importante interleucina 1 2 3 e 4 que controlam inflamação podem ser utilizados em tratamento de câncer tratamento da Aids tratamento em que a pessoa passa por radiação ou quimioterapia tá então para controle aí do sistema imuno do sistema imune anticorpos monoconais a gente tem diversas doenças que podem ser Auxiliadas no tratamento que podem ser auxiliados com o uso de anticorpos e também na pesquisa ou para diagnóstico de doenças esses anticorpos também são interessantes interferons que também controlam nosso sistema imune tá diminuindo

um pouco a sua resposta quando a gente tem uma doença causada por uma inflamação exagerada Como pode acontecer no câncer tá como pode acontecer em casos graves alergia as artrite e algumas outras infecciosas a Gente tem diversas proteínas que são de grandesíssimo interesse tá fatores de coagulação fatores de crescimento humano a própria insulina vem falando há um bom tempo e gf1 né que é o fator de crescimento parecido com a insulina e até mesmo as vacinas que podem ser formadas a partir da proteína de um determinado vírus que a gente passa a produzir ela em

bactéria em uma célula de mamífero por exemplo faz um concentrado dessas proteínas injeta na Pessoa a ser imunizada o sistema imune dela vai passar a reconhecer aquela proteína então quando ela entrar em contato com a gente patógeno que costuma produzir aquela proteína é quando entrar em contato com vírus da gripe por exemplo ela vai gerar uma ela já vai ter né uma memória imunológica ele vai ter uma resposta bem mais rápida Contra esse patótipo então produzir proteínas é algo muito muito interessante do ponto de vista econômico porque tem um alto valor Agregado Então são produtos

que demandam muito a tecnologia não são fáceis de ser produzidos então a gente consegue vender eles bem bem caros inclusive normalmente os tratamentos que envolvem proteínas recombinantes são aqueles tratamentos mais caros do mundo que de vez em quando aparece no G1 a uma menina uma criança com uma doença muscular super Rara precisa do tratamento mais caro do mundo que cada vidrinho custa um milhão normalmente é Uma proteína recombinante que tá ali presente naquele vidrinho tá muito corpo muito especial ou uma proteína mesmo que aquele indivíduo não produz e que vai ser introduzida a partir da

produção dela recombinante em laboratório Ótimo então proteínas são super valiosas porque a gente dão opções novas de tratamento para diversas doenças que não teria muito o que fazer tá sem essa opção da das proteínas dos anticorpos só que por outro lado Elas são tão caras Porque são muito complexas então é difícil de conseguir produzi-los então é tão tão difícil de conseguir produzir que a porcentagem de pesquisa para gerar uma proteína recombinante que dá certo é algo ali na casa dos cinco por cento três por cento tá para uma droga né que é pesquisada pela Indústria

Farmacêutica passar por todas as fases de teste Clínico até chegar no mercado tem uma taxa de sucesso baixíssimo Então nesse preço que é muito muito caro também tá Incorporado todas essas o dinheiro que foi gasto para gerar essa pesquisa das drogas que não deram certo também então acaba que esses produtos baseados em proteínas já governantes são muito muito e são muito muito caros porque as proteínas são moléculas muito complexas precisam estar numa estrutura 3D adequada uma estrutura tridimensional própria para que elas exerçam para que elas consigam exercer a sua atividade nessa é uma enzima que

vai acelerar uma Determinada reação se é um anticorpo que precisa se ligar a uma determinada molécula eles precisam estar na forma correta numa forma perfeita então é bem difícil a gente conseguir manter essa forma perfeita né a aula passada a gente falou sobre o sistema de expressão e tem que determinadas proteínas que precisam ser montadas nas cadeias de aminoácidos pressão ser montadas sem adicionado um grupamento um açúcar um lipídio um fosfato para aí sim ela se tornar ativo E não é qualquer sistema de expressão que tem a capacidade de gerar essa proteína funcional né normalmente

uma proteína de mamífero que receba uma modificação pós tradicional ela normalmente vai precisar ser expressa ser produzida por células de mamífero tá porque ou no mínimo eucarioto né que tenha a maquinaria para conseguir produzir aquela proteína da maneira correta então bactérias por exemplo não conseguem fazer glicosilações que a Adição de carboidratos depois que a proteína já tá pronta isso já mata uma grande parte das proteínas que no nosso corpo só funcionam Se tiverem essa glicosilação tá então o processo que depende de um processo complexo que depende da tecnologia e essa tecnologia é cara então seguindo

o nosso protocolozinho né o nosso passo a passo de como gerar um organismo a GM e no final obter minha proteína purificada a gente já viu as Etapas de isolar e preparar o meu DNA de interesse contendo lá o gene da proteína que eu quero produzir escolhemos o vetor apropriado então se for um vetor de expressão é preciso ter uma região promotora forte para que esse Gene seja bastante Expresso Sou algo para ser expresso em eucarioto onde o RNA tem que ser processado Tem que adicionar a calda poliar né que a gente viu lá no

processo de transcrição na biologia molecular para que o RNA mensageiro esteja maduro Seja de fato traduzido gerada proteína Já selecionamos o nosso fragmento e fizemos a clonagem a inserção desse fragmento no vetor estão geramos o nosso DNA recombinante foi aquela etapa que a gente falou muito sobre enzimas de restrição é pontas coisivas para conseguir juntar duas moléculas de DNA numa coisa só inserir o meu gene de interesse dentro do vetor né tive que abrir o vetor encaixar aquele Gene Certinho Tá parte a gente já viu transformamos a nossa bactéria então garantimos que aquele DNA do

gene de interesse foi de fato inserido corretamente dentro da bactéria ela passou expressar a tal o talgênio né que eu coloquei lá beleza essa etapa a gente já viu a gente tem até o gênesis de seleção né que a célula ou a bactéria ela pode a partir do vetor né o vetor traz aquele Gênese de seleção de resistência antibiótico pode expressar Uma proteína verde fluorescente pode degradar a lactose tá a gente genes repórteres né que dizem para a gente se a bactéria ou organismo foi corretamente transformado se ela recebeu certinho aquele vetor da maneira que

ele tinha que estar contendo o DNA de interesses beleza selecionamos as células né Então a partir desse genes repórteres a gente soube identificar Quais que foram corretamente transformadas e quais que Receberam um vetor vazio ou não receberam vetor nenhum a gente conseguiu fazer essa seleção selecionamos só as transformadas só os organismos que deram certo show e agora que eu tenho os organismos selecionados eu preciso verificar se a proteína está sendo produzida de fato E purificar essa proteína que é o que de fato me interessa tô produzindo o organismo a GM depois que eu produzi o

organismo ótimo né só manter ele em cultura que sempre Eu vou ter aquele organismo produtor de insulina Mas para eu conseguir vender a insulina eu preciso retirar a insulina de dentro da bactéria ou retirar a insulina do meio de Cultura onde essa bactéria tá crescendo Então chegou a hora da gente falar das etapas finais que é a obtenção e Purificação das proteínas de combinantes então a gente já selecionou ali as minhas nesse caso né uma bactéria é cólera o organismo transformado geneticamente modificado Recebeu lá o plasmídeo cresceu o suficiente show então agora que a gente

já tem uma grande quantidade desse organismo geneticamente modificado agora a gente vai partir para Purificação dessa proteína Tá então vamos ver etapa por etapa então após a transformação ou seja conseguir inserir Meu DNA recombinante corretamente as células do sistema de expressão que pode ser bactéria pode ser um carioto então levedura fungo pode ser célula de inseto Pode ser célula de mamífero como a gente viu na aula passada precisam ser concentradas e Preparadas para que a gente obtenha a proteína recombinante Então a primeira coisa que precisa acontecer é a extração das proteínas totais dessa solução onde

eu tenho o meu microrganismo geneticamente modificado eu preciso tirar dali daquela solução a minha proteína de interesse e aí vem a primeira pergunta que é essa proteína de interesse ela é uma proteína Extra celular ou intracelular se ela é uma proteína Extra celular ela é secretada para fora da célula Então a gente vai pegar o meio de cultura e fazer o processo a partir do meio de Cultura Afinal a sala produziu a proteína jogou para fora se a proteína for entra celular então a gente vai ter que pegar a célula concentrar essas células romper essa

célula né Quebrar sua membrana causar ali uma ruptura na membrana para liberar o seu conteúdo e Dentro desse conteúdo eu vou achar minha proteína de interesse tá ou seja de qualquer maneira eu vou ter as proteínas naturalmente produzidas pelo meu sistema de expressão aí colhe vai continuar produzindo as bactérias proteínas necessárias para sobrevivência dela levedura célula de mamífero sala de inseto todas elas precisam produzir proteínas para garantir a sua sobrevivência elas vão produzir suas Proteínas mas a proteína de expressão né que eu proteína recombinante que eu inserir o gene lá nesse micro-organismo tá então preciso

separar as proteínas que não me interessam dar minha proteína de interesse a minha proteína alvo Beleza então essa vai ser a primeira etapa de extração total extração das proteínas totais e depois que a gente ouve tivesse essa extração nesse extrato bruto a gente vai precisar purificar exatamente realizar essa Separação das Proteínas que são naturais do meu sistema de expressão daquela minha proteína de interesse e essa parte é onde complica um pouco mais porque é um processo que é difícil é Custoso no sentido de que exige tecnologia cara exige tempo tá para produzir uma boa quantidade

e normalmente a eficiência dessa Purificação é o passo limitante normalmente você vai ter uma produção aí de algumas gramas por ano lá no máximo assim um quilo vamos dizer 1 kg é A melhor produção mais eficiente possível você vai ter um quilo de uma proteína por ano mas o normal é ficar ali em poucas gramas tá então é uma produção muito custosa porque a eficiência baixa a gente não consegue produzir um grande volume uma grande quantidade de proteínas a extração intracelular e extracelular tem uma complexidade parecida A única diferença é que quando foi intracelular a

gente vai ter que rasgar essa célula No meio romper a sua membrana Tá mas os processos são basicamente iguais a grande diferença é o que que você vai começar Qual o material que você vai usar para começar essa Purificação se você vai usar as células ou se você vai usar o meio de cultivo aonde essas células cresceram mas o processo em geral as técnicas envolvidas são iguais tá e esse processo de purificação ele tem uma eficiência baixa e é caro e complexo Porque a gente tem que tomar um cuidado muito muito grande para não danificar

ou não desnaturar essa proteína de interesse a gente precisa que ela esteja na sua forma perfeita para aquela execute a sua função se essa forma for modificada durante meu processo de purificação eu vou perder a atividade dessa enzima e não vou conseguir remontar ela depois então se eu usar um processo químico muito agressivo eu posso desligar algum agrupamento químico Que tava grudado nela se eu tinha um fosfato ligado eu dou um banho de ácido muito muito forte faz com que isso foi fato Se desligue e esse foi fácil se desligando muda a forma da proteína

ela não vai mais executar sua função Então existe um equilíbrio que a gente tem que fazer né entre conseguir extrair o máximo possível mas mantendo essa proteína na sua forma ativa sem perder a sua capacidade de realizar a função tá sem mudar sua forma Então terceiro ponto é uma escalabilidade ruim a gente consegue fazer esse processo de uma eficiência Ok em laboratório em pequenos bioreatores Mas se a gente pensar numa indústria né que tenha um Bio reator aí de 500 litros 200 litros para tentar produzir para uma grande distribuidora esse processo é pouco eficiente cada

vez a gente vai perdendo perdendo perdendo mais proteínas durante as etapas de purificação Então mesmo com uma grande material prima Inicial né que seria meu organismo a GM produtor lá da proteína de interesse é um processo onde ele tem uma baixa eficiência onde eu vou conseguir poucas proteínas recombinantes no final é o que faz com que as proteínas já combinantes sejam tão caras quando chegam para o tratamento né quando chegam para farmácia por exemplo onde a gente consiga comprar e por fim a gente tem que ter um cuidado Com o armazenamento a gente vai ter

que preparar essa proteína de uma forma para que ela não perca a sua estrutura durante o armazenamento e Distribuição então muitas vezes essa proteína recombinante ela vai ser armazenada e transportada em armazéns e caminhões que sejam refrigerados que mantém uma temperatura ali no menos 20 pelo menos até menos 80 porque o frio garante que eu vou manter a estrutura Ali da proteína que ela não vai perder a sua atividade Então hoje a gente vai explorar essas três etapas a etapa de extração etapa de purificação e a etapa de preparo para o armazenamento e Distribuição desse

produto que é a minha proteína recombinante então começando pela extração se essa minha proteína recombinante ela for entra celular eu vou precisar causar uma Lise dessa célula ou seja vou ter que romper a sua membrana rasgar essa Célula no meio para ela liberar o seu conteúdo Existem algumas maneiras de fazer isso a gente pode usar ciclos de congelamento e descongelamento e os cristais de gelo que são formados vão causando furos na membrana plasmática da célula isso vai acabar fazendo com que ela tá com aquela se rompe a gente também pode usar detergente que vão também

criar poros na membrana né vão os detergente eles são moléculas anfiáticas conseguem interagir com os Fortesfolipídeos da nossa membrana plasmática isso faz com que buraco sejam abertos então mesma lógica a célula vai ser rompida e também podemos usar métodos mecânicos como a trituração tá das células por exemplo passar num mecanismo que vai literalmente triturar essas células vai despedaçar elas partículas pequenas então obviamente eu vou a membrana da célula ou passar por esse processo chamado de sonicação que eu trouxe aqui esses dois gifs para Vocês verem que é um que é uma técnica né que não

é tão comum assim que é uma agitação muito muito forte da solução utilizando o ultrassom Então esse tubinho aqui de metal ele tá emitindo ondas sonoras de alta intensidade tá emitindo pulsos ali dentro da minha solução isso faz com que dentro da solução ou tenha áreas de alta pressão e baixa pressão nessa área onde eu tenho uma alta pressão O meu líquido ele acaba se tornando gasoso por meio segundo ele Se torna um gás isso faz com que a molécula fique muito agitada e que acaba se desprendendo umas das outras Então eu tenho uma Lise

fácil né da membrana celular utilizando essa técnica essa técnica também é utilizada para limpar joias se você já tiverem visto algum vídeo no YouTube de um cara limpando de prata um anel de Diamante que tava todo sujo ele joga dentro de uma solução que tá numa maquininha de metal e começa a sair um vaporzinho assim em volta dessa Dessa joia né o que ele tá fazendo ali é uma sonicação então utilizando ondas sonoras para agitar essas moléculas movimentar essa solução tá Então nesse primeiro exemplo aqui ele tem uma camada de óleo outra camada de água

com a sonicação a gente consegue ter a mistura dos dois por mais que um seja totalmente hidrofóbico e a água seja hidrofílica com a sonicação é possível criar uma mistura chamada de emulsão e aqui simplesmente misturando um sólido com a Água tá Beleza então extrair minhas proteínas consegui romper lá o interior das células Agora eu preciso concentrar ou precipitar essas proteínas e a técnica mais utilizada que tem essa técnica de saltim Out que é meio que precipitar ou tirar de solução utilizando o site Então como é que essa técnica é baseada né Qual é o

conceito por trás dessa técnica você vai adicionando sal até chegar em altíssimas concentrações esse sal que Vai sendo adicionado a sua solução que contém a proteína ele vai reduzindo a solubilidade da proteína na verdade esse sal ele vai roubando as moléculas de água que estavam interagindo com a proteína antes então acaba que as proteínas vão agrupar elas vão formar como se fosse um grupinho de proteína uma colada na outra que é mais ou menos o que essa primeira imagem aqui tá mostrando tá no primeiro momento eu tenho lá A minha solução com as proteínas solubilizadas

elas estão espalhadas nessa solução quando eu adiciono os cátions de valente é um cátion de valente quer dizer que eu tô adicionando íons tá e uns de carga positiva sejam mais dois mas não necessariamente precisa ser mais dois qualquer um pode ser o sódio pode ser o cloreto menos tá pode ser sulfato essa quatro que são os exemplos que estão aqui Posso adicionar NSL quando eu jogo o sal nessa solução ele vai se dissociar em na mais e ser L menos posso jogar O sulfato de amônio que é o nh42 so4 quando eles entrarem em

contato com a água vão se separar aí eu vou ter amônia para um lado nh4 e O sulfato para o outro tá como eles são carregados aqui como eu tenho mais ou menos isso quer dizer que eles são lindos então eles têm uma carga como eles têm carga e a minha molécula de água é polar ele tem uma Alta afinidade entre si Então tá aqui o desenho da minha molécula de água né H2O se a gente reparar o ó é o polo negativo oxigênio é o polo negativo da molécula de água e os hidrogênios são

o Polo positivo da molécula de água então por isso que a gente diz que a molécula de água é polar que existe um lado que está carregado positivamente outro lado que está carregado negativamente então A água ela tem muita facilidade ela é muito atraída por qualquer coisa que seja carregada os íons por ter o símbolo aqui em cima menos e mais já indicam que eles são super carregados então a água tem muita facilidade de interagir com eles os íons acabam atraindo as moléculas de água para si muito mais do que as proteínas Então antes a

água a molécula de água tava interagindo com as proteínas quando eu adicionei esse monte de sal as moléculas de água agora vão se Voltar todas para os sites vão interagir com essas moléculas de sais ou interagir com os meus íons e não vão mais interagir com as proteínas então só vai sobrar proteína para interagir com a proteína então elas vão grudando uma na outra vão formar grupos que a gente chama de grumos e com esse bolo de proteína uma encaixada na outra ela acaba saindo de solução ela perde a sua solubilidade Então ela repito e

vai parar lá no fundo do tubinho tá então Tem um artigo aqui que chama até os sais né que são os cátions de valente de cola para proteínas e quando a gente adiciona na solução as proteínas colam umas nas outras formando esses grumos aqui se bololô de proteína então o processo que a gente está olhando esse processo aqui né de saltim Out então quando pega uma proteína joga uma solução Se eu jogar numa solução que seja água destilada ela não vai solubilizar muito bem ela vai se Solubilizar melhor se essa água tiver um pouquinho de

sal é isso que ele tá mostrando nessa primeira parte aqui do gráfico tá e que não nos interessa muito nesse processo aqui de separação de purificação da proteína mas só para você saberem proteínas Não solubilizam muito bem em Água totalmente destilada água que não tenha sal conforme eu vou adicionando sal eu aumento a solubilidade das minhas proteínas elas se tornam mais solúveis ficam ali Misturadas na água a gente não consegue enxergar o precipitado né não enxerga nada no fundinho do tubo tá aí ficam misturadas na solução igual quando você adiciona sal ou açúcar na água

e Mexe os grãozinhos ali de sal e açúcar tomem né se dissolvem na solução beleza só que conforme a gente vai adicionando mais e mais e mais e mais e mais sal chega no ponto que esse sal rouba todas as moléculas de água que estavam interagindo com as proteínas tá então Nessa situação aqui as proteínas estão interagindo com várias moléculas de água passinho aqui e algumas moléculas do sal também sem problema nenhum terá responsável interage com a água quando eu encho essa solução de sal então eu coloco muito muito sal mesmo tá deixa uma concentração

elevadíssima como a água tem uma preferência interagir com os íons do sal do que com as proteínas porque os íons são mais carregados são mais polares acaba que todas as Moléculas se voltam para os íons e deixam as proteínas não interagem muito bem mais com as proteínas então Sobra para as proteínas interagirem entre si e quando elas interagem entre si elas colam mas nas outras vão formar os grumos e acabam saindo de solução bom precipitar vão ser depositadas lá no fundo do tubinho isso para gente que quer purificar que quer separar essa proteína É ótimo

É o perfeito né o processo perfeito para gente então Basicamente a gente tem uma solução com todas as proteínas misturadas proteína do meu sistema de expressão e a minha proteína de interesse quando eu taco um monte de sal aqui dentro muito muito sal as minhas proteínas vão precipitar vão sentar lá no final do meu tubo lá no fundinho do tubo Então tem um videozinho aqui que não é exatamente uma purificação de proteína tá na verdade ela tá separando água do metanol Então ela tá separando Água e Álcool a gente sabe que a água e Álcool

mistura mas o sal tinha out essa técnica de adicionar muito sal também funciona para separar os dois tá vou mostrar aqui Então ela tá lá adicionando o álcool meti o álcool e tá adicionando a água ela vai adicionar também um corante só para que a gente consiga enxergar esse processo acontecendo tá para facilitar porque o álcool é transparente a água é transparente então para ficar mais fácil De ver Então nesse momento como ela jogou uma em cima da outra tá tudo misturado água com álcool ela tá colocando essa solução não agitador Então essa pecinha de

metal aqui o Magneto ou bailarina agita na gira e homogeneiza essa solução Beleza ela tá lá homogeneizando a solução agora tá tudo misturadinho o álcool o álcool a água e o corante que ela adicionou só para que a gente enxergue e Agora ela vai começar o processo de saltim-out então ela vai começar deixa adiantar um pouquinho a explicação dela ela vai começar a adicionar sal e não é pouco sal ela vai à vontade mesmo pega o pote vai virando então é bastante sal que a gente vai adicionar tá uma concentração bem elevada ela adiciona ajeita

ali o Agitador para gerar direitinho e tome sal é tanto sal que o sal já não tá nem mais solubilizando na solução né já fica a Partícula ali embaixo precipitado Já tô no limite da concentração no limite da solubilidade desse sal vamos adiantada aqui no que ela tá falando mas não acabou foi solubilizado então adiciona mais tem que adicionar até o limite até ficar sal no fundo e não se misturar mais na solução pode ser um sulfato de amônia pode ser o cloreto de sódio nacl né padrão nosso Sal de cozinha qualquer sal vai gerar

íons a gente tem a separação nas duas frações a gente tem o álcool misturado ao corante aqui em cima exatamente um quilo de sal virou pote né e a água aqui embaixo tá transparente ela não tá ligada ao corante ou seja duas substâncias que são altamente missíveis né os dois são hidrofílicos se misturam muito bem conseguem ser separadas A Partir dessa técnica de saltim Out então seu adicionar muito muito sal numa solução a água vai ter preferência para interagir com esse sal e vai parar de interagir com uma outra molécula que ela estava interagindo então

eu vou gerar duas frações nessa solução aonde eu tenho álcool e aonde eu tenho a água então consigo separar depois né só pegar uma pipeta Sugar toda a parte de cima vou separar um do outro beleza Show então todos esses processos eles precisam ser feitos de uma maneira tão escondidas as abas todos esses processos Precisam fazer de uma maneira em que o Preserve a estrutura da proteína então a gente sabe passar aqui para o próximo slide mas eu volto tá que existem três coisas que modificam a forma de uma proteína uma proteína pode ser modificada

por mudança de temperatura então quando do calor que é o processo que acontece quando a gente Frita um ovo é a Clara é transparente depois que a gente frita o ovo a gente desde maturou a Albumina do ovo ela fica branca ganha a cor branca tá Se você pegar um limão espremer em cima do ovo ele a Clara também vai ficar esbranquiçada a mudança de PH é Outro fator que faz com que eu mude a forma da proteína e a adição de grupamentos químicos a essa proteína ou a retirada dos grupamento químicos também vai mudar

a sua forma tá então a gente precisa ter Esse processo uma maneira muito cuidadosa muito equilibrada para manter os elementos químicos que estão ligados a essa proteína muitas proteínas são produzidas nessa forma inativa e só se tornam ativas depois de ganharem essas modificações pode ser adição de um oh adição de uma ligação de sulfato adição de um açúcar um metil um acetil um fosfato uma uma tagzinha uma proteína chamada sumo um lipídio tem 200 modificações possíveis que as proteínas Podem sofrer a gente tem que preservar todas elas o máximo possível tá então eu poderia né

se não fosse isso eu poderia pegar essa solução que eu tenho minha proteína Então tá água e a proteína que misturadinha no meio e ferver eu boto a 100 graus a água evapora Só vai sobrar proteína de fato só que vai sobrar a proteína completamente desnaturada e não funcional mesma coisa você usasse um agente muito ácido ou muito básico tá também aconteceria desnaturação da Proteína seria muito mais fácil de purificar extrair só que ela não estaria na sua forma correta não em executar sua função e eu não consigo fazer com que ela volte muitas vezes

eu não consigo fazer com que ela volte para o seu estado funcional para o seu estado ativo então que a gente faz é preservar ao máximo a forma da proteína então todos os processos são feitos no frio normalmente a menos 20 tá todo momento Essa solução é enfiada no gelo em Laboratório quando a gente tá fazendo esse tipo de processo e também sempre utilizando solução tampão para manter esse PH estável para que eu não desligue um grupamento químico que possa estar ligado nessa proteína além disso a gente ainda precisa se preocupar com a degradação dessa

proteína Então se por acaso não é o nosso caso que a gente tá tirando de Ah não as células também podem ter Né verdade Então dependendo da proteína que A gente está extraindo a nossa célula pode ter proteases que quebram essa proteína então preciso garantir que as proteases que estão presentes na minha células sejam inativadas então para isso eu vou ter que adicionar inibidores de proteases muitas vezes esses inibidores vão ser a gente químicos né um açúcar um tipo especial de molécula ou até mesmo proteínas para inibir essas proteases e a gente também precisa se

preocupar Com contaminação Então pode pode ter outro microorganismo que acha aquele ambiente onde está minha proteína recombinante bom para crescer e contamine a minha solução quem já fez cultura de célula e alguma vez sabe que contaminação é um problema sério e que é fácil de acontecer microorganismo cresce literalmente em qualquer lugar cresce no vulcão cresce no fundo do mar cresce sem luz sem comida no metal então micro-organismo cresce de Qualquer jeito não precisa de muita coisa para uma bactéria crescer um fungo crescer Então a gente vai usar antibióticos ou antifúngicos para prevenir qualquer tipo de

contaminação para que eu consiga gerar um produto que a minha proteína com Grande no final seja purificada ou seja que não tenha contaminante né de outras microrganismos que possa causar algum mal porque no final quero usar essas proteínas no paciente então tem que estar 100% Purificado tá Beleza então passamos pela fase de extração agora vamos a purificação de fato e para fazer a purificação da proteína a gente tem vários métodos diferentes a gente pode fazer uma centrifugação pode fazer uma filtração passar essa solução por um filtro e separar moléculas pode fazer eletroforese que a gente

já conversou sobre essa técnica na Correia num gel e pode fazer uma cromatografia Então vamos Ver rapidamente cada um desse processo a centrifugação a essa altura já deve ser Bem óbvio para vocês né que é aquela máquina que gira as soluções em alta velocidade gerando altas forças gravitacionais então quando a gente gira um qualquer coisa né vira um sólido a gente acaba gerando uma força chamada de força centrípeta vou ter que desenhar de cabeça para baixo né tá aqui no YouTube Contendo a proteína no tubinho com a tampa tá fechado pronto eu tô girando ele

conforme eu vou girando girando girando girando né quanto mais rápido eu giro maior essa força no sentido do fundo do tubo então eu empurro as moléculas mais pesadas para o fundo do tubo tá então essa imagem aqui mostra isso para gente muito bem é uma imagem que não tá tratando da purificação de proteínas de um sistema ogm ele tá falando de uma Purificação de proteínas de uma biópsia de fígado mas que serve para gente então ele pegou um pedaço do tecido homogeneizou aqui mecanicamente com esse pistão rotativo ou seja rompeu as células todas rompeu as

células eu tenho lá mitocôndria tenho uma cisterna do Gold tem os núcleos ainda presente nessa solução tá então eu não quero essas organelas né porque a princípio minha proteína ela tá presente no citoplasma tá pode ser que essa Proteína esteja presente no núcleo e você queira isolar só um núcleo para depois tirar sua proteína recombinante Mas normalmente a maior parte das proteínas combinantes vão ficar ali pelo citoplasma mesmo Então beleza no primeiro momento ele nem precisa levar para o centrífuga só dele deixar a solução parada quietinha ali já é o suficiente para aquele material mais

pesado de cantar então se você preparar um leite com Nescau e deixar o copo parado ali 15 minutos você vai ver que o Nescau vai decantar vai parar lá no fundo do copo que a molécula do Nescau pode Nescau é mais pesado é mais denso Então vai parar lá no fundo mesma lógica daqui depois ele leva esse sobrenadante então a parte que não está precipitada né ele leva para centrífuga e aí começa a girar essa amostra em várias intensidades várias velocidades diferentes né velocidade crescente normalmente ele começa ali com 600g esse G é força gravitacional

e aí separa o núcleo o núcleo vai precipitar aqui embaixo ele pega sol sobrenadante e faz uma nova centrifugação aí já passa a ser uma ultra centrifugação então a gente já tá falando aqui de 15.000g é muita muita força para conseguir atingir esse tipo né de velocidade precisa ser uma ultra centrífuga então com uma outra centrífuga consigo separar várias vesículas consigo separar as organelas Na mitocôndrias ou soma peroxoma mais velocidade ainda o geram ainda mais força separa os microssomas com mais velocidade ainda você para até os ribossomos dessa solução tá então a centrifugação é uma

maneira de separar por densidade de acordo com a velocidade de rotação que eu tô aplicando naquela amostra quanto mais denso for a substância mais fácil ela vai descer e formar um pallet formar o precipitado aqui no fundo do tubo então quando forma Precipitada no fundo do tubo eu consigo separar do restante que ainda está em solução segundo método que a gente pode utilizar é a filtração então filtração é literalmente utilizar um filtro tá a gente escolhe um filtro que tem a poros de tamanhos conhecidos né tamanhos específicos e aí a gente consegue separar as moléculas

Normalmente quando você fala de filtração precisa-se de duas etapas uma microfiltração e uma Outra filtração então a microfiltração tá aqui no gráfico retira moléculas ou organismos né nessa faixa aqui de tamanho tá de 0.1 para cima micrômetros Então vai impedir a passagem vai filtrar né deixar fora as bactérias alguns corantes aqui é outro corante hemácias nem ao caso né mas obviamente vai tirar as células é uma das menores células do nosso corpo então células inteiras já não vão passar se não passa Nem bactéria né não vai passar sela inteira e depois vai fazer uma segunda

filtração em que o filtro tem um cloro ainda menor e aí a gente passa a chamar de outra filtração agora a gente tá no 0.0 um micrômetro de tamanho desse porém então que vai passar por ali são proteínas né gelatina também a proteína pode passar algumas toxinas que são um moléculas pequenas podem passar alguns pequenos vírus tá vírus é um conjunto de proteína Então tá dentro do tamanho das Coisas que a gente quer deixar passar de fato né Afinal a gente tá indo atrás da nossa proteína recombinante a gente vai fazer primeiro uma microfiltração depois

uma ultra filtração separando as proteínas das outras moléculas né escolhendo um tamanho de poro para que eu consiga separar proteína já tem um certo peso molecular normalmente a filtração é uma etapa intermediária ela não é eficiente o suficiente eficiente o suficiente para gerar uma purificação de 99% que é o que é necessário para levar esse produto para venda tá para o comércio e tem um problema também que o filtro entope fácil né as partículas vão grudando ali na membrana vão bloqueando a passagem do poro chega uma hora que ele para de funcionar você tem que

substituir aquele filtro um outro tipo de filtração que existe é a diálise na diálise ela separa duas substâncias a partir da concentração das Duas soluções normalmente é diálise ela é usada para tirar os sais que ele um quilo de sal que a gente adicionou para né É para decantar a proteína para concentrar proteína é normalmente nessa etapa aqui que a gente vai tirar tá utilizando essa técnica então ela vai fazer basicamente uma difusão né ela vai deixar passar um solvente do lado mais concentrado para o lado menos concentrado até chegar em equilíbrio Então eu tenho

aqui Um saquinho fechado contendo minha solução com as proteínas e muito muito sal que são as bolinhas pequenas eu vou colocar esse saquinho que tem certos poros tá poro de tamanho conhecido fora de tamanho pequeno né então ele não vai deixar a proteína passar por esse porco fora menor que a proteína mas vai deixar o sal passar e vou colocar dentro de uma solução pouco concentrada né ou uma solução que seja água só basicamente E aí o sal que Tá muito concentrado aqui dentro do saquinho vai sair para o lado de fora do saquinho equilibrando

o lado de fora e o lado de dentro ou seja no final das contas eu consegui diluir o material que estava aqui dentro né o sal que estava aqui dentro porque as proteínas não saíram então a concentração ficou igual alguém levantou a mão aí vai perguntar alguma coisa eu Professor posso falar claro com certeza Então você falou no outro método aí da filtração sem ser esse o outro que isola proteína mas se eu quiser isolar uma proteína específica né porque você falou que passam algumas delas se eu quiser isolar uma proteína específica esse método Então

não é possível né não porque você só seleciona por tamanho é uma na verdade a filtração Você nem tem tanta precisão assim para dizer qual é o tamanho tá que você vai definir o tamanho de um poro Vamos dizer aqui definir o tamanho do poro todas as proteínas que são maiores do que esse poro não passam mas todas as proteínas que são menores pode ser a estrela pode ser o triângulo pode ser a bolinha pode ser o quadrado vão conseguir passar por esse filtro dentro desse Polo Então na verdade você fez uma separação mas você

não purificou totalmente a proteína que você quer você melhorou um pouco a situação ali né que você se encontrava você tinha mil Proteínas diferentes Agora você tem 200 proteínas diferentes misturadas com a sua melhorou mas ainda não resolveu ainda não purificou totalmente tá então são normalmente etapas intermediárias de filtração e centrifugação mas não conseguem resolver no nível que a gente precisa tá não consegue purificar na intensidade que a gente precisa beleza show então a filtração por diálise segue Exatamente a mesma lógica Então coloca um poro que seja bem pequenininho que a minha proteína de interesse

não passe por ele então somente moléculas pequenas vão conseguir atravessar esse poro então normalmente as moléculas de sites e proteínas menores carboidratos que sejam pequenos lipídios que sejam pequenos que podem estar presentes aí vão vazar para o lado de fora do saquinho E aí eu consigo purificar um pouco tá dois dessa mistura que eu tinha aqui Então essa etapa ela é mais importante para eu remover os sites que eu adicionei lá durante a fase de saltim-out para eu remover os solventes e aditivos que eu tive que adicionar como os inibidores de protease e os antibióticos

ali tá não esquecer que a gente teve que adicionar coisa para garantir a pureza dessa solução outra técnica que a gente pode utilizar e essa sim é mais precisa a gente consegue pontuar melhor Aonde está minha Proteína separada das outras é eletroforese então eletroforese a gente já falou nas aulas passadas como funciona mas é basicamente um gel que vai formar uma malha então também vai formar poros pequenos tá a gente adiciona a nossa amostra nesses Buraquinhos aqui nesses slot e a gente tem um lado do gel ligado no polo negativo o outro lado do gel

ligado no Polo positivo a gente pega a nossa proteína todas as proteínas Dessa amostra e trata com esse agente químico aqui chamado SDS tá esse a gente químico ele vai dar carga negativa a nossa proteína então que ele vai fazer esticar essa proteína toda então não importa se a proteína antes que a carga positiva carga neutra ou negativa agora todas as proteínas depois de serem tratadas com esse STS vão ter a mesma carga que a carga negativa tá Então nesse momento aqui a carga já não importa mais a gente vai separar as Proteínas baseadas no

tamanho então quando eu ligar esse sistema elétrico aqui as proteínas como elas têm carga negativa né Por Conta do SDS elas vão migrar em direção ao Polo positivo as proteínas pequenas Elas têm mais facilidade para passar no meio dessa malha que é o meu gel passar no meio desses poros que o gel forma então elas conseguem avançar mais rápido do que as proteínas maiores do que as proteínas pesadas Então se a gente reparar aqui Depois que ele liga tem várias bandinhas sendo formadas essas bandinhas são referentes a proteínas de diferentes tamanhos o lugar que ela

para diz para a gente qual é o tamanho dela Então quem para mais embaixo é uma proteína menor quem para mais em cima conseguiu se deslocar menos no meio desse labirintozinho do gel feito de vários poroszinhos Então ela é uma proteína maior então aqui a gente consegue fazer uma separação específica Né ah se eu sei que a minha proteína recombinante ela tem que pesar tem Kilo daltons que a unidade de medida que a gente usa para proteína Então vou pegar as proteínas que caírem aqui nessa faixa ó formou uma bandinha aqui nessa faixa então a

minha proteína de interesse Com certeza tá aqui tá então consigo purificar ela então isso é ótimo quando a gente tá num numa montagem de laboratório né fazendo os testes iniciais mas para fazer algo a nível Industrial essa eletroforese ela é pouco eficiente ela é lenta quantidade de proteína que a gente consegue isolar aqui a cada corrida é muito muito pouco é o que microgramas que a gente isola é pouquíssimo porque isso Então essa é uma técnica ótima eficiente no sentido né de na eficiente a palavra precisa tá uma técnica precisa consigo isolar a minha proteína

ali que eu quero mas é uma técnica pouco eficiente porque eu vou gerar pouca proteína purificada no final Vou ter minha proteína purificada vou mas vou ter baixa quantidade esse aqui é um sistema de um gel 1D unidimensional Então o a minha amostra só vai para baixo tá só tem uma direção né cima e baixo existe também a eletroforese 2D que eu consigo resolver com ainda mais precisão Porque caso tenha outras proteínas que pesem exatamente sem cadear mesmo peso da minha proteína de interesse elas também vão parar aqui também vão estar compondo Essa bandinha que

para aqui então quando eu isolar essa bandinha vou pegar todas as proteínas que pesam exatamente sem cadeado pode ter não vai ter a minha proteína recombinante mas pode ter outras proteínas naturais da célula do micro-organismo também tá então já o 2D é uma maneira de separar um pouco mais as proteínas E aí como é que é feito esse gel 2D a gente tem uma fitinha especial onde eu tenho um gradiente de PH Então nesse Pedaço aqui o PH é um nesse pedaço aqui o ph2 esse pedaço aqui o ph345 alguém quer perguntar alguma coisa se

tinha aberto o microfone 789 14 então cada segmento dessa fitinha tem um PH determinado Tá beleza então a gente vai fazer uma eletroforese nessa fitinha aqui vou adicionar a minha amostra aonde o ph7 ph7 é pegar em outro beleza tá aqui a minha amostra vou adicionar a Corrente Então tá aqui um lado é polo negativo outro lado é polo Positivo tá minhas proteínas tem cargas então elas vão se vão se movimentar vão se mover em direção a carga oposta ela né porque negativo atrai positivo atrai negativo Então as proteínas que tem carga negativa vão migrar

para o polo mais para o polo positivo proteínas tem carga positiva vão migrar para o polo menos tá então a gente tem aqui agora uma separação das proteínas de acordo com a Sua carga depois eu vou pegar essa fitinha aqui onde as proteínas já estão separadas por carga e vou encaixar na parte de cima do meu gel de eletroforese então isso aqui essa fitinha é uma eletroforese eu vou fazer agora a segunda eletroforese que é baseada em tamanho então separei primeiro por carga agora você parar por tamanho então vou ter um gel agora em duas

dimensões da esquerda para direita Eu determino a carga dessa proteína Então você tá para Esquerda é porque é uma proteína positiva porque ela andou em direção ao polo negativo se tá para direita é uma proteína com carga negativa Porque ela foi em direção ao Polo positivo e o qual o tamanho dela baseado enquanto ela migra se ela migra pouco É porque ela é pequena tá tem facilidade para passar ali no meu gel então a mesma limitação que eu tinha no anterior é um processo Preciso né consigo extrair A minha proteína ali de uma maneira precisa

com poucos contaminantes continua sendo aplicado para o gel 2D né Agora é mais precisa ainda porque eu tirei proteínas que tenham cargas diferentes você vai garantir com que eu pegue a minha proteína recombinante com ainda mais precisão só que a eficiência de purificação ainda é baixa então para a indústria não é a maneira com que eles produzem né purificam suas proteínas E aí a gente chega na última não a última Técnica né a última técnica mas é a mais importante que é a cromatografia eu não sabia se você já conheciam a cromatografia que é uma

técnica bioquímica né hoje a gente está muito na bioquímica hoje é uma aula mais pesada de bioquímica então eu trouxe aqui a técnica para a gente relembrar ou aprender como que funciona a cromatografia Eu tenho um tubo normalmente de vidro mas pode ser de plástico também e aqui dentro desse tubo Eu tenho uma resina essa resina é feita de microsferas que inglês é chamado de bide que tem um poro no meio ela tem um caminho no meio dela pronto tá desenhado caminhozinho tá a todo momento eu estou adicionando uma solução tampão em cima dessa Matriz

aqui de resina tá das minhas microsferas eu tô adicionando essa solução tampão para hidratar minha resina e também aonde eu vou adicionar minha amostra depois então essa solução de Tampão entra aqui passa pelo meio da resina hidrata resina e sai aqui pelo outro lado então esse tubo tem dois furos um furo por onde ele recebe a solução e outro furo por onde a solução sai no final tá beleza então isso aqui montadinho né A minha meu tubo com a resina e a solução tampão passando no meio a gente chama de coluna cromatográfica ou coluna de

cromatografia show quando eu adicionar a minha amostra nessa coluna de Cromatografia eu tenho uma moléculas que são grandes moléculas que são pequenas as moléculas que são grandes vão desviar dessas microsferas e vão descer passar reto as moléculas que são pequenas elas vão ter que passar no meio da microsfera para conseguir chegar lá no final ou seja a molécula pequena vai demorar mais para descer a molécula grande vai passar mais rápido vai descer mais rápido Então adicionei lá a minha amostra tinha vários elementos nessa amostra né Várias moléculas diferentes a mais pesada desce primeiro a mais

leve fica retida mais tempo demora mais para descer para passar esse descer a gente chama de Eloir tá que a gente está passando a solução aqui e ela vai descer vai elogia não sei porque escolher esse nome mas é o nome utilizado e aqui embaixo a gente tem vários tubos em sequência vários tubinhos de ensaio para coletar o que tá pingando ali do final então primeiro vai pingar a minha Molécula mais pesada depois uma molécula mais ou menos não tá aparecendo os likes seria uma parte de um filtro filtro deionizador isso que é o a

manta né a tela o carvão ativado e a resina tipo isso é uma lógica parecida é uma lógica bem parecida o filtro de ionizador é o filtro de água né eu demorei aqui para me ligar o que que é é uma loja o deionizador é ele tem três estágios Diferentes mas tem uma diferença aí né que no filtro as partículas grandes elas ficam retidas e nunca vão passar para o final nunca no final você troca o teu filtro ele tá lá com uma cor preta né sei lá de gasto uma cor que tá ali com

todas as moléculas presas moléculas grandes presas aqui na cromatografia a molécula grande vai passar ela vai sair do outro lado só vai demorar para ela sair tá Não tem essa diferença a gente consegue pegar a molécula Grande no final Essa é a diferença do filtro para cromatografia também então na cromatografia vai passar tudo vai passar só vai passar em horas diferentes Primeiro vai passar o mais pesado o maior depois vai passar o mais leve no filtro não no filtro só vai passar do tamanho que eu escolhi o poro do filtro para baixo menor do que

aquele tamanho de poro tá o que for maior do Que o tamanho de fora não vai passar nunca vai ficar preso ali no filtro e é por isso que o filtro entope porque chega uma coisa gigante para um furinho desse tamanho senta ali no furinho não vai conseguir passar Vai tapar esse furo Então vou precisar aquele filtro vai entupir né vou ter que trocar o filtro por exemplo na cromatografia todas as substâncias vão seguir vão conseguir passar beleza Então o que vai acontecer que eu vou adicionar minha amostra aqui contendo várias proteínas de vários tamanhos

diferentes eu vou ter que ter uma noção mais ou menos Qual é o tamanho da minha proteína para saber qual o frasco que me interessa então aqui na verdade que tá aonde minha proteína Vai parar Então eu tenho lá ó moléculas grandes proteínas grandes né grande tamanho vão driblar essas microsferas vão passar Mais rápido então elas vão cair aqui nos primeiros tubinhos eu tenho uma sequência de tubinho para coletar Todo o material que cair que for evoluído dessa coluna de cromatografia Então tudo um não caiu nada no primeiros minutos não caiu nada no tubo 2

também não caiu nada no tubo 3 já começou a cair alguma substância ali a gente se for transparente a gente não vai saber que aquela substância tá caindo a gente vai ter que fazer um teste depois para Entender em qual tubinho que ela caiu mas se fosse um corante por exemplo a gente veria esse corante descendo aqui no terceiro minuto por exemplo tal terceiro tudo então primeiro vão descer as partículas grandes e aí essas partículas grandes vão caindo aqui nos primeiros tubos tubo 3 tubo 4 depois vai descer as partículas de tamanho médio e aí

vão cair aqui no tubo 5 tubo 6 e por último vão descer as partículas ou as proteínas de tamanho Menor E aí vão cair nos tubos seguintes tudo 7 Tudo 8 Então eu consegui separar as proteínas por tamanho tem as menores num tubo e as maiores em outro tá e as menores elas demoram mais para Eloir para sair aqui da minha coluna cromatográfica porque elas têm que passar aqui pelo meio das microsferas então o caminho percorrido por elas é maior elas levam mais tempo para conseguir chegar nesse final aqui é como se ela estivessem que

passar por um Labirinto enquanto as proteínas grandes estão andando quase com um caminho reto tá então chega mais rápido tá que nesse exemplo do gifzinho que tá até bem rápido né Eu tenho uma amostra de corante que eu na minha coluna cromatográfica que na verdade é uma amostra que tem dois componentes e dois tamanhos diferentes o azul e o amarelo o amarelo é maior então ele passa na frente né Ele é eluído primeiro Sai primeiro e o azul que é menor ele fica Preso na coluna mais tempo sai por último Então a gente consegue separar

esses dois a lógica aqui no desenho adicionei minha amostra só mostra vai correr aqui no meio das microsferas da resina então vou ter a separação daquilo que são as proteínas ou as moléculas pequenas tão pequeno ficar para trás do que são as moléculas ou proteínas grandes que vão correr na frente vão evoluir primeiro aí eu consigo separar moléculas grandes ou proteínas grandes Das moléculas pequenas ou proteínas pequenas então isso aqui é importante a lógica da cromatografia é inversa da eletroforese né eletroforese que a gente acabou de falar o menor chega primeiro na cromatografia não o

menor vai chegar por último tá tem essa diferença na cromatografia a gente também usa a gravidade a gravidade que está empurrando essa solução ou é uma pressão que a gente coloca ali para empurrar Essa solução mais rápido e na eletroforese a gente está usando Eletro corrente elétrica tá de duas diferenças mas que são diferenças muito importantes principalmente Qual é o tamanho da molécula que vai chegar ao final primeiro faça as micro esferas elas são vendidas em diferentes tamanhos de poro que a gente consegue selecionar o tamanho do Polo de acordo com o tamanho da proteína

De interesse que eu quero separar tá então esse é o método mais básico de cromatografia que é chamada de cromatografia por exclusão de tamanho então a gente consegue separar proteínas ou moléculas de tamanho diferente mas ela ainda não é preciso o suficiente para Purificação ela faz purificações preliminares então começaram a fazer modificações a essa técnica e aí Aumentou a precisão dela antes de falar das modificações possíveis Essa técnica cromatográfica ela sofreu alguns avanços científicos nos últimos anos ela passou a ser feita através de alta pressão então ao invés de eu depender somente da ação da

gravidade para empurrar esse líquido pela resina e Cair lá a minha proteína no final agora eu dou uma pressão aqui nessa solução E aí a proteína corre mais rápido essa ação de purificação acontece mais rápido então que a gente demorava horas para purificar com hplc a cromatografia de Alta pressão ou cromatografia de alta performance também pode ser chamada assim vai acontecer em pouquíssimos minutos existe uma alimentação que é aumento da pressão diminui um pouco a eficiência da Purificação no final mas vale a pena porque aumenta muito a velocidade desse processo tá Então esse processo aqui

de htlc é o que comumente é usado nas indústrias Então quando você vai comprar um anticorpo lá Da termo lá da in vitrogen lá da Merck das marcas famosas vai estar escrito lá como ele foi purificado na tabelinha dele no Datasheet que é o arquivo Zinho que vem dizendo as informações da cliente corpo e normalmente vem escrito que ele foi purificado Por hplc que essa técnica aqui que a gente tá vendo que a cromatografia só que com uma bomba pressionando esse líquido para ele correr mais rápido Eloir mais rápido na minha coluna cromatográfica Beleza e

essa técnica de cromatografia sofreu algumas alterações para que aumentasse a precisão da seleção da proteína que afinal eu quero o máximo de purificação possível uma das modificações que fizeram é a cromatografia por troca de íons então adicionar um carga na resina na resina que compõe ali a minha coluna cromatográfica então se a sua proteína de interesse tem carga positiva você vai fazer uma resina que tem a carga Negativa se a sua proteína de interesse tem carga negativa você vai fazer uma resina que tem a carga positiva porque quando a sua amostra né o seu extrato

bruto foi adicionado ali na coluna o positivo vai interagir com negativo a sua proteína recombinante vai ficar presa na coluna então ela vai sair por último e todo o resto vai sair primeiro você pode jogar fora e só pegar a sua proteína de interesse ali no final tá então moléculas não carregadas ou que Tenham a mesma carga que a resina vão passar direto não vão ficar retidas ali na coluna Então tá aqui a lógica nessa ilustração na minha no meu extrato bruto na minha amostra eu vou ter carro vou ter moléculas e proteínas de diferentes

cargas proteínas que são muito positivas proteínas são poucos positivas proteção pouco negativas e proteção muito negativos Então nesse caso aqui a Proteína de interesse tem mais cargas positivas então ele fez lá uma resina que tem carga negativa e quando essa proteína passou por aqui ela vai se ligando a essas resinas Então ela praticamente não passa ela fica travada Ela gruda interage fortemente ali com essa resina tá então todo o outro resto que tem carga negativa que tem carga positiva só que muito muito leve vai passar direto e no fim eu vou ter lá a minha

proteína presa nessa coluna Cromatográfica tá ela faz essa interação eletrostática né onde eu tenho cargas Opostas se atraindo então para eu tirar ela daqui eu só preciso adicionar algo que seja mais positivo do que a proteína porque aí a minha resina vai se ligar a essa coisa mais positiva vai deixar a proteína embora aí eu pego ela aqui no final quando eu adicionar essa solução então tava adicionando uma solução de tampão neutra agora vou adicionar uma solução de tampão que tenha muito Muito scations né seja muito positivo então quando esses cátions passarem aqui pela minha

resina eles vão se ligar na resina e a proteína vai se desligar da resina eu pego ela purificada lá embaixo outra modificação possível é uma cromatografia por afinidade então se a proteína que eu quero isolar é uma enzima vamos dizer que ela é uma Sei lá lactato desidrogenase isso quer dizer que ela se liga ao lactato e modifica esse lactato de alguma forma Então ela Consegue se ligar especificamente ao lactato né Tem uma ligação muito forte com lactato se liga de uma maneira muito específica e reversível né a gente sabe que a enzima se liga

no seu elegante porque eles têm um encaixe quase que perfeito tá o encaixe molecular né quase que perfeito então forma uma ligação bem bem forte então se eu quero isolar essa lactato desde hidrogenase se eu fizer uma resina que tenha lactato na ponta a minha lactato desidrogenase vai Conseguir grudar vai se ligar esse lactato vai ficar retida também na coluna cromatográfica Então vou conseguir tirar ela depois a que eu dei outro exemplo que é o exemplo da insulina então se eu quero produzir lá minha insulina recombinante eu coloco na resina na microsfera de resina o

receptor de insulina então quando a insulina passar ela vai se ligar esse receptor fortemente e vai ficar preso ali todo o resto todas as outras Proteínas vão passar vão ser levadas embora depois é só desligar essa interação aqui utilizando uma solução carregada de sal por exemplo E aí eu vou conseguir obter a minha insulina recombinante tá Então tá aqui a ilustração mostrando isso eu prendo na minha resina o ligante então aquilo no que a minha proteína recombinante se liga por afinidade tá como por exemplo insulina e o seu receptor de insulina então eu boto aqui

O receptor de insulina quando a insulina passar por essa coluna tá aquecendo representada pela bolinha verde ela vai se ligar a esse receptor vai ficar preso ali todo o resto sai elui primeiro então vai embora e aí no final eu pego só a fração Contendo a minha proteína recombinante minha proteína de interesse tá isso pode ser feito como eu falei agora utilizando a enzima e seu substrato utilizando uma proteína em seu receptor como também posso fazer com Anticorpos então se eu utilizar um anticorpo anti insulina aqui como receptor também serviria também resolveria meu problema e

a gente ainda pode fazer mais a gente ainda pode produzir a proteína recombinante com uma tag com uma sequência de aminoácidos ou uma pequena proteína acoplada ela para que eu consiga realizar essa etapa aqui de purificação com alta precisão Então esse tipo de cromatografia aqui que é Cromatografia por afinidade é a que tem maior precisão é a que vai conseguir purificar mais tá a minha proteína de interesse você vê que o restante da amostra sai bem antes e minha proteína de interesse só vai sair quando eu adicionar aqui uma solução muito carregada de sal para

fazer o saltim out que ele mesmo processo que a gente viu a uns slides atrás tá então eu posso lá no início pensar já nessa etapa de purificação e ao invés de eu produzir só A insulina né pegar lá o gênio da minha célula inserir na bactéria eu posso inserir esse Gene da insulina um pouquinho modificado para que na ponta dessa insulina eu tenho uma sequênciazinha de aminoácidos que me permita selecionar essa proteína tá então existe esses sisteminhas um exemplo essa proteína que chamada de Spy tag E spyketcher então no Gel eu tenho lá o

spiker aquilo que vai Se ligar na proteína Spy e colada na minha proteína recombinante que tá aqui a bolinha cinza eu tenho o que vai se encaixar no Sky Catcher que é o pai tag tá então aqui ó meus pai tag é esse pedacinho azul Então vou produzir minha proteína recombinante contendo Essa sequênciazinha especial de aminoácidos e quando passar ali pela minha coluna de cromatografia a minha microsfera tem a proteína que vai se encaixar perfeitamente vai segurar minha Proteína recombinante ali naquele lugar eu vou conseguir purificar de uma maneira eficiente então a gente pode não

simplesmente produzir a proteína recombinante igual a ela é no meu mamífero na minha célula né como ao caso a insulina dentro da gente a gente pode produzir uma proteína que seja um híbrido que tem uma tagzinha que tenha um conjuntinho de aminoácidos que Vai facilitar lá na frente quando eu precisar purificar ela então a gente Chama essa esse tipo de raciocínio de estratégia né de proteína híbrida que é uma proteína imerizada ela tem uma ponta um segmento que não é natural a ela a gente está fugindo uma coisa com a outra tá então pode ser

literalmente duas proteínas fundidas só que glutationa é uma proteína bem pequenininha então posso ter minha proteína que insulina ligada aglutationa Então tá aqui ó meu Gene da Insulina adiciona o gênero da glutationa logo em seguida dele tira o stop cordão aqui do final tá para quando essa proteína passa pela tradução né seja produzida eu faça um híbrido eu Gere uma proteína que é insulina ligada aglutationa Então eu só vou ter o stop cordon aqui no final da glutationa tá não tem Stop cordão aqui na insulina então ele vai gerar uma mega proteína uma proteína que

é uma fusão de duas então tá aqui a Minha proteína que é uma fusão de duas depois então você vai facilitar muito para fazer a purificação né a purificação que é feita na cromatografia por afinidade que a gente acabou de ver aqui como funciona e depois que eu purifiquei eu consigo utilizar por exemplo proteases para clivar essas duas proteínas para separar essas duas proteínas aí eu vou ter minha insulina de um lado glutationa de outro e aí eu consigo separar uma da outra tá Vai me exigir Mais uma etapazinha de purificação mas pelo menos eu

consegui obter mais fácil né Essa proteína conseguir purificado de uma maneira mais fácil mais simples único problema é que eu tenho que pensar isso lá no início lá quando selecionei um incerto de DNA que eu vou inserir no vetor tá então isso tem que ser planejado então uma tagzinha que é muito muito comum essa tagzinha de histidina onde são seis estidinas ligadas em sequência então tem vetores Específicos por exemplo que já tem essa tagzinha já tem esse código para produzir seis estidinas na ponta da proteína Então você vai lá coloca o seu DNA de interesse

ali no vetor né liga certinho a sua célula o seu sistema de expressão vai começar a produzir a sua proteína recombinante com uma sequência de discidina na ponta a estatidina tem alta afinidade pelo níquel tá o metal Então quando você passar o seu extrato bruto Aqui por essa coluna de cromatografia a sua proteína que tem a cadeia distinguina vai ficar presa nessa coluna e todas as outras proteínas vão evoluir vão sair da coluna cromatográfica você pega essa aula de proteínas aqui joga fora depois que todo mundo saiu você faz um saltim out Ou coloca um

agente químico que substitua a estidina tá então esse imidazol é uma molécula que tem a forma Quase Idêntica da estigma e vai tomar o lugar dela na coluna Cromatográfica Então esse nidazol vai se ligar na resina aonde a gente a proteína que tem estava se ligando então a proteína que tem China vai sair da coluna cromatográfica você pega ela lá no final purificado tá só existem várias tagzinhas de fusão vários híbridos híbridos Que Vocês conseguem produzir pode fundir uma glutationa na ponta que aí Ela gruda na resina que tem a glutationa reduzida você pode produzir

uma proteína Recombinante que tem a estilina na ponta e você vai pegar ela na coluna de cromatografia onde a resina tem níquel ou Cobalto você pode fazer uma fusão produzir a sua proteína recombinante que tenha uma mbp na ponta uma proteína que se liga maltose na ponta e aí é só você produzir uma resina que tem a destina um tipo de Açúcar eles vão se ligar uma na outra então vai conseguir fazer cromatografia por afinidade ou você pode usar um tipo de proteína que você tenha Anticorpos para aquela proteína Então por afinidade aquela proteína recombinante

vai ficar presa ali na coluna cromatográfica as outras vão embora você joga fora depois você consegue pegar aquela sua proteína de interesse sua proteína recombinante de uma maneira separada logo purificado tá Então tá aqui mais ou menos como que fica essa solução em cada etapa então no primeiro momento quando eu tenho lá meu extrato bruto simplesmente Peguei as células lisei todas elas Eu tenho um conteúdo muito grande de proteína e uma grande quantidade de solução né um litro e meio aqui de solução e 10 gramas de proteína que é muita muita coisa show então toda

a minha proteína recombinante está aqui dentro Mas eu também tenho muita proteína que não é a minha proteína de interesse não é minha proteína recombinante Eu preciso purificar cada etapa de purificação se a gente olhar Aqui em Atividade se eu estou perdendo atividade é porque eu estou perdendo um pouquinho da minha proteína recombinante tá então faça uma primeira precipitação já perdi um pouquinho de proteína recombinante aí faça uma cromatografia de exclusão por tamanho ou troque já perdi mais uma quantidade considerável de proteína faça uma cromatografia de afinidade que é mais precisa já perdi praticamente 50%

Da proteína recombinante que foi produzida Então essa etapa essas etapas de purificação são muito muito importante porque eu vou conseguir tirar todos os meus contaminantes nas proteínas que não me interessam proteínas naturais do meu sistema de expressão da minha ecólia da minha célula de inseto da minha célula mamífera mas eu também durante esse processo perca um pouco da minha proteína de interesse não tem como um Processo 100% eficaz tá então a cada vez que a gente purifica também perde um pouco da proteína recombinante infelizmente faz parte então o processo que gera a maior Purificação infelizmente

ele acaba gerando também a maior perda de proteína recombinante Tá mesmo assim vale a pena é a técnica mais utilizada porque a técnica que vai me permitir chegar no 99% de Pureza que é a concentração de Pureza exigida pela Anvisa e por todas as outras agências Reguladoras protestar para começar a testar uma droga em paciente então para começar o teste Clínico eu já preciso ter uma proteína 99% purificado não posso ter outros contaminantes tá só que só para mostrar um gel de eletroforese porque depois de ter purificado eu preciso confirmar que aquela proteínazinha que caiu

no tubinho por último foi eluida por último É de fato a Minha proteína que eu tô Mirando que eu tenho como alvo tá então preciso verificar garantir que aquela proteína Então posso fazer uma eletroforese com por exemplo um Ash tem blot West tem Bloch é eletroforese mais a utilização de anticorpos tá então eu uso um anticorpo anti a minha insulina recombinante por exemplo se um anticorpo grudar É porque era insulina mesmo se o anticorpo não grudar É porque era outra proteína com peso molecular idêntico e Que tava me enganando e que eu caí tá posso

fazer Elisa utilizando anticorpos posso fazer essa técnica que chamada de espectrometria de massas que é uma técnica muito complexa e que ela também tem a capacidade de purificar proteínas Tá mas isso eu vou deixar para vocês aprenderem mais para frente não vamos abordar na nossa disciplina que isso aqui é uma pós-graduação inteira para desenvolver bem essa técnica é uma técnica bem complicado Pode fazer cristalografia de raio-x onde você meio que tira uma foto utilizando raio x da proteína então você vê se ela tá no formato correto do que você espera que seja a sua proteína

recombinante e a mesma coisa para crio eletromicroscopia onde você tira uma foto no microscópio eletrônico dessas proteínas para ver se ela tá na forma correta que você esperava né para sua proteína recombinante para esse gelzinho de eletroforese seria Uma dessas etapas de verificação por exemplo tá aqui ele adicionou o extrato de células Não induzidas beleza no do lado o de células induzidas Então se a gente reparar tem uma banda nova aqui ou seja começou a produzir uma proteína de um peso molecular que ela não produzia antes Opa Então só pode ser o meu gênio que

eu inseri lá na lá na bactéria né o gênio que eu selecionei para criar o meu organismo ogm beleza do lado ele colocou o extrato bruto então o extrato bruto eu Tenho várias proteínas que não são somente aquela de interesse a minha de interessar lá no meio mas tem vários contaminantes e aqui para a direita ele começa com as técnicas de purificação primeiro a precipitação utilizando salto em Alt conseguiu até purificar bem aqui só que ainda tem contaminantes aqui tá se essa imagem tivesse melhor uma definição um pouquinho melhor provavelmente a gente veria outras bandas

aqui em cima também só que elas Devem estar bem fraquinhas e aqui para direita as cromatografias diferentes cromatografia por troca iônica e por fim a proteína purificada de fato então depois que ele purificou a proteína ele pode confirmar que era nessa faixa aqui mesmo que a gente esperaria que ela seria produzida tá beleza e depois que conseguiu purificar só precisa prepará-la para ser armazenada e transportada então para isso vai ser esse processo chamado de Liofilização que é uma criocecagem Então você congela proteína Depois você coloca ela numa câmara que vai gerar vácuo e quando você

gera vácuo você vai tirar totalmente a pressão daquele sistema não vai existir mais molécula de ar e tem duas coisas que fazem com que a matéria do nosso mundo né as moléculas esteja no estado gasoso líquido ou sólido é a temperatura e a pressão quando você tira a pressão a água ela consegue ir do seu estado líquido para o gasoso Desculpa ela consegue do seu estado sólido para o gasoso direto sem passar pelo líquido então consigo desidratar aquela proteína aquela solução sem fazer com que ela perca a sua forma tá então esse é o processo

de liofilização que a maioria dos Remédios e maioria das proteínas combinantes vão se passar para que elas sejam armazenadas uma maneira correta né que Preserve a sua atividade e para que elas consigam ser transportadas também sem perder Atividades beleza Então por hoje é isso nos próximos dias até a aula que vem eu prometo que eu trago o trabalhinho Extra tá coloca lá no Drive e aviso vocês e vai ser algo bem próximo aquelas últimas questões lá do PCR talvez adicione alguma coisinha a mais só uma questãozinha mais ou outra mas vai ser bem naquele estilo

Tá certo então vou Interromper a gravação aqui é só isso só isso tudo