Mutagênese e Carcinogênese 2021 parte prática

o Olá pessoal tudo bem nessa aula de hoje a gente vai falar um pouquinho sobre os testes que são utilizados para se avaliar o potencial mutagênico é carcinogénico de algumas substâncias químicas essa aula seria referente a uma parte prática mas eu não tenho a intenção de ensinar para vocês nessa aula como são feitos Quais os passos de cada um dos Testes isso a gente já não fazia Mesmo durante o ensino presencial a minha ideia é falar para vocês e mostrar alguns testes que são muito utilizados e os critérios para escolha desses testes a quando há

a necessidade de se testar o disse avaliar o potencial mutagênico é carcinogénico de uma substância química Então vamos lá ó é bom primeiro a gente tem que saber que a existe um número muito grande de substâncias sejam substâncias naturais ou seja substâncias que são feitas ou produzidas pelo homem para que seja possível realizar os testes de potencial mutagênico e carcinogênico para cada uma de peça substâncias sendo assim Nem todas as substâncias vão precisar passar por ensaios a de avaliação de potencial carcinogênico a maioria dos dados sobre a carcinogénese vende estudos feitos em laboratórios antes de

se liberará as substâncias para para uso e a Inês estudos são utilizados cultivos celulares são utilizados estudos em animais é Para que sejam então liberadas essa Olá sejam elas substâncias para uso geral sejam novos medicamentos para uso pelo homem quais seriam Então os critérios para que se libere o que que você tem que avaliar para se liberar uma substância e não não não tem necessidade de realizar avaliação desse potencial carcinogênico bom primeira coisa que a gente tem que avaliar é a ocorrência ambiental dessa substância se ela é feita pelo homem ou se ela é naturalmente

presente no ambiente em se ela for naturalmente presente no ambiente a Quais os locais onde ela está presente e quais são as características da exposição humana a essa substância é uma substância que vai ser utilizada como medicamento é uma substância que é utilizada como um agrotóxico ela vai estar presente na alimentação vai ser utilizada a pressão então a gente avalia Quais são as características da exposição humana e quando a gente faz a junção dessas informações ocorrência ambiental exposição humana a gente começa avaliar qual a população que está sob o risco de se sofrer mesmo algum

efeito advindo da exposição a essa substância então a gente consegue avaliar as diferenças entre consumo para populações diferentes se os efeitos a em adultos e em crianças são os mesmos se a diferença racial interfere na resposta do organismo a exposição aquela substância então a gente começa a caracterizar o risco da exposição humana a essa substância não é necessário também que a gente tenha informações sobre a estabilidade EA persistência dessa substância no ambiente se ela é facilmente degradada Quais são os sub produtos de degradação E se eles têm características ou potencial de promover alguma toxicidade se

as estruturas químicas presentes nessas substâncias estão ou não relacionadas a estruturas conhecidamente carcinogênicas então lembrando da segunda parte da nossa aula teórica a gente avalia a presença daqueles grupos químicos sejam para carcinogênes diretos ou indiretos e avalia e essa presença como potencial ou não carcinogeno se essa substância não pertence a nenhuma classe farmacológica que já está previamente associada é aquela cirurgia densidade aí nesse caso Vale também para o substâncias que não atuam como medicamentos para outros tipos de classe é mesmo que não sejam farmacológicas mas outros tipos de substância que não ser classificados na mesma

classe que já tem potencial carcinogênico reconhecido se foram realizados já alguns Alguns estudos de curta duração principalmente em relação ao potencial carcinogênico e não foram observadas alterações relevantes que indicassem o potencial carcinogênico e principalmente essa substância a vai ser utilizada tem como propósito uma utilização com uma frequência baixa durante curtos períodos de tempo porque nós sabemos que para a maioria das substâncias a carcinogénese e ela é observada é quando a gente fala ou quando a gente expõe o organismo o devido ao uso crônico e não ao uso agudo de algumas substâncias então depois que a

gente avalia todas essas características a gente sabe se pode ou não liberar uma substância da necessidade de se realizar os testes para avaliação de potencial mutagênico e carcinogênico é muito importante lembrar que sozinhos esses estudos eles não vão afirmaram não vão passar para a gente sem por cento de certeza de que uma substância é ou não capaz de promover Câncer em humanos mas nós sabemos que para a maioria das substâncias que testam positivo nos ensaios com cultivos celulares e com animais a chance é muito grande de essas substâncias também testar em positivos caso ela se

e anda para o consumo humano Porque que a gente não afirma isso com certeza Normalmente quando a gente faz um ensaio para avaliação de potencial mutagênico e carcinogênico em animais principalmente nós fazemos a exposição desses grupos de animais a doses muito mais altas do que seriam as doses comuns para consumo humano daquela substância por quê que isso é feito dessa maneira para que a gente possa utilizar números menores um grupo ou menor de animais e ainda assim consiga detectar o Câncer se vocês pensarem nos mecanismos Gerais que eu apresentei para vocês de mutagênese e carcinogênese

na primeira parte dessa aula vocês vão ver que o câncer é um evento relativamente raro de acontecer ele tem que acontecer com uma mutação e ele naquela naquele local do DNA que tá vinculado a formação de neoplasias depois tem que haver a exposição a a uma agente promotor ou progressor então não é um evento que ocorre com tanta frequência quando a gente avalia a estatisticamente as possibilidades de ocorrência desse evento quando a célula é exposta a um agente carcinogênico então a gente faz esses estudos com doses um pouco mais altas em animais justamente para ser

possível reduzir o número de animais utilizados em cada um dos estudos a avaliar esse potencial a já em humanos aí é substância tem que ter sido liberada dos ensaios ou de ter passado pelos ensaios em cultivo e em animais e ter a demonstrado ausência de potencial carcinogênico então uma vez liberada a substância para uso humano nós podemos fazer alguns estudos que vão confirmar para a gente ausência desse potencial mutagênico é carcinogénico então a gente pode fazer estudos epidemiológicos sejam eles estudos de populações ecológicos estudos caso-controle estudos de corte estudos de intervenção ah e também podemos

fazer estudos moleculares avaliar marcadores genéticos de susceptibilidade ao câncer que são aqueles genes Aqui nós já sabemos que quando sofrem alguma mutação aumentam a chance de uma pessoa desenvolver essa doença a gente pode usar marcadores biológicos de dose interna e de dose efetiva ou seja avaliar a presença da substância em si ou de seus metabólitos no sangue na urina ou no local no sítio alvo aí já um pouco mais difícil que é um marcador de dose efetiva a gente pode avaliar respostas biológicas EA presença de mutações genéticas também utilizando amostras biológicas de um ano mas

de maneira nenhuma a gente vai fazer o estudo em humano da mesma maneira que a gente faz em animais pegando um dos a distâncias e deliberadamente a aplicando nos humanos para ver se ela causa câncer Então são estudos observacionais de substâncias que já estão em utilização pela população Ok bom em relação à ainda a avaliação da carcinogenicidade nós temos diversos tipos de testes disponíveis para se avaliar esse potencial carcinogênico de substâncias químicas é quem é que delimita os protocolos quem é que delimita os indicações quem é que delimita a como esses testes devem ser feito

você não diversas agências reguladoras a mais famosa delas é a USB que disponibilizam testes ou protocolos para se realizar esses testes de potencial é o caso do SBT nem somente de potencial carcinogênico disponibilizam protocolos para se testar diversos organismos diferentes para todos os tipos de substância quanto ao potencial toxicológico de uma maneira geral basta que vocês entrem no site e faça uma busca com palavras-chave do tipo de teste que você quer fazer o que você quer ter o protocolo isso fica liberado não é necessário fazer o pagamento algum pagamento para se obter esses protocolos e

todo mundo tem acesso esses testes disponíveis eles normalmente são divididos em duas categorias que são baseadas na duração do teste então a primeiro a gente costuma iniciar os testes de avaliação de potencial carcinogênico com aqueles testes que a gente chama de testes de curta duração e esses testes duram mais ou menos é entre um três meses algumas semanas são testes realmente bem curtos rápido são creches mais simples e mais baratos de se fazer que são geralmente testes realizados em cultivo celular esses testes eles dão para gente a uma visão inicial em geral do potencial carcinogênico

e geralmente eles defendem para gente se vale a pena a gente seguir adiante com os testes de avaliação de potencial carcinogênico e fazer os testes de média e longa duração principalmente os testes de média duração e longa duração costumam ser agrupados hoje média duração costumam avaliar a formação uma lesão o meu plástica eles são testes que vão aí de 2 a 8 meses de duração e em animais e o Sérgio de longa duração são os bioensaios crônicos em animais esses aí são testes que duram entre 18 e 24 meses normalmente a gente utiliza roedores para

fazer esse teste de longa duração E aí esse período de tempo tá relacionado à exposição a praticamente durante praticamente toda a vida do animal aquela substância química que você quer avaliar então vou falar um pouquinho sobre cada um desses testes a baseados na duração deles uma coisa importante de se lembrar ou de se avaliar quando a gente vai definir qual o tipo de teste é necessário realizar para avaliar a substância química que a gente tem interesse é que é um teste ele pode detectar genotoxicidade carcinogenicidade ou muita gente cidade então você tem que pensar no

teste que você vai escolher para avaliar o potencial de carcinogénese dos da sua substância ou se ele vai detectar só genotoxicidade só mutagenicidade se aquilo vai te dar a resposta que te interessa para avaliação da segurança para o uso da substância que você tá querendo testar Ok bom falar um pouquinho sobre os testes de curta duração para avaliação da carcinogenicidade a nossa sabemos que esses testes geralmente são desenvolvidos presidente Ficar principalmente o potencial mutagênico o DNA seja em Vivo ou seja in vitro e aqui eu coloquei para vocês um exemplo de cada um dos Testes

de curta duração dos tipos de teste de cada de curta duração para que vocês tenham uma ideia da variação da quantidade de testes que cê tem esse número de testes muito maior do que esse que tá nessa tabela então a exemplo de testes de curta duração que são testes bastante comuns o teste de mutação gênica em vidro que ao teste de Ames esse teste eu vou explicar para vocês um pouquinho mas também são muito comuns o teste de indução de anormalidade na espermatogênese que é um teste de mutação gênica em vivo e a alteração promocional

em Vivo que ao teste de micronúcleo e a alteração cromossomial cromossomal in vitro que é o teste de troca de avaliação de troca de cromátides irmãs existem outros tipos de testes você tem que escolher de acordo com a substância que você quer a testar vou falar para vocês um pouquinho sobre alguns desses testes primeiro teste que eu coloquei aqui para vocês é o teste de Ames esse teste ele pode ser feito com a uso de cepas de salmonella definir typhimurium e China negativa ou cepas de e cole você pode escolher aí de acordo com a

facilidade que o laboratório que você trabalhar te oferecer como que a gente faz esse teste de Ames primeira coisa que a gente tem que lembrar e é que existe em carcinógenos químicos que vão atuar diretamente e indiretamente como a gente viu lá na aula se o Cássio pode a substância que a gente quer avaliar vamos carcinógeno químico direto é essa primeira parte aqui do teste que vai falar para a gente a sobre a utilização de uma fração microssomal de enzimas hepáticas metabólicas do fígado ela não vai ser necessária Mas se a substância que a gente

quer avaliar foi um carcinógeno químico indireto é necessário que a gente utilize é uma fração microssomal de enzimas do fígado no exemplo aqui a gente tá usando enzimas do fígado de um rato para que essas enzimas metabolismo e o seu carcinógeno indireto ou pro carcinogeno em uma substância carcinogênica se isso aqui não estiver presente a sua substância foram para sinnott Geno indireto o seu teste vai ser um falso negativo Ok como que funcionam bom a salmonella typhi molho histidina negativa ela eu não tenho eu não consegue crescer em um meio que não ofereça para ela

a histidina ela não consegue produzir no metabolismo dela aí te Dina então meio tem que ser suplementado com histidina essas cepas de bactérias usadas no teste de Ames elas também tem ser cepas que tem dificuldade ou deficiência em reparar o DNA porque porque se a sua substância foram montar uma substância montar gênica mas o DNA foi reparado a gente não vai enxergar o efeito da mutagênese no resultado E aí também você vai ter um falso negativo Ok como que a gente começa a fazer o teste então primeira coisa que a gente faz é a no

Animal em vivo rato Ninja é uma substância que seja capaz de aumentar a expressão de enzimas do metabolismo por exemplo as enzimas do citocromo p450 a gente faz a injeção dessas substâncias em uma vez que a passada uma semana da ingestão dessa substância A gente coleta o fígado desse animal faz um homogenato do fígado desse animal centrífuga e coleta a fração do sobrenadante que contém as enzimas microssomais responsáveis pela metabolização e se você não tiver informação nenhuma sobre o teu carcinógeno ser direto ou indireto pelo sim pelo não você usa essa fração microssomal se ele

for direto ela não vai fazer diferença nenhuma se ele for e indireto ela vai fazer diferença porque ela vai gerar o carcinógeno depois da metabolização depois que a gente obteve essa fração microssomal a gente vai pegar o cultivo de bactéria e a nossa substância teste e vai misturar vai crescer isso no meio de cultivo que seja quase histidina negativo também ou seja ele vai ter um traço sozinho só decidindo uma quantidade baixa de histidina para permitir um crescimento Inicial dessas bactérias mas que vai ser rapidamente consumido E aí a gente vai transferir a mistura para

uma placa de Petri e transferindo essa mistura para uma placa de Petri Aí sim o h dessa placa não pode conter este Dina a gente faz uma incubação por dois dias e avalia a presença de colônias nessa placa de Petri Como o meio é este Dina negativo só vão crescer nessa placa aquelas bactérias que conseguiram o que sofreram alguma mutação no Gene que produz histidina que a gente diz revertente e então passaram até a capacidade de produzir a histidina consequentemente crescer mesmo no meio sem China e faz a contagem dessa placa de Petri e o

mesmo procedimento total que a gente fez para o cultivo com a sua substância química você também faz para um grupo controle só que sem a sua substância química depois que a gente finalizou o período de incubação e contou as colônias que estão presentes aqui nessa placas de Petri a gente faz o cálculo do que a gente chama de índice de mutagenicidade Ou seja a gente divide o número de revertentes Induzidos que é o número de colônias que foram revertidas pela minha substância química dividido pelo número de revertentes espontâneos ou seja o número de colônias da

minha placa de Petri do meu grupo controle por que que a gente vai encontrar uma outra colônia nessa placa é porque mutação espontânea acontece em qualquer organismo vivo no nosso na bactéria no rato Então existe a chance de a bactéria naturalmente sofrer uma reversão da ausência de capacidade de promover histidina de produzir histidina e crescer também um meio sem histidina então a gente faz essa divisão se esse número for igual a 1 ou seja número de Vertentes induzidos igual ao número de resistência espontâneos isso indica que não houve indução de advertência substância não é uma

substância capaz de induzir mutagênese se esse número estiver menu ou entre 06 0,7 ou seja o número é a de revertentes a induzidos tá ali perto de a um mais mostra que o meu ser Vertentes espontâneos estão número maior do que os meus induzidos Pode ser que essa substância seja tóxica não carcinogênica mais tóxica ela tá matando os as minhas bactérias que seriam revertentes espontâneas mas que estariam aqui na minha placa do grupo teste e se esse número for maior do que um pode indicar a ainda com ressalvas o algum potencial carcinogênico da minha substância

química mas se esse número for maior ou igual a 2 ou seja o número de revertencia Induzidos é o dobro daquele observado para o revertente espontâneo aí sim eu considero que a minha substância é uma substância muita gênica Ok Esse é um teste simples porque esses verem vocês podem observar que a gente gasta uma semana e meia mais ou menos para chegar a um resultado o material utilizado neste teste é um material barato e é um teste então de muito baixo custo ele costuma ser um dos Testes mais comuns para serem realizados para início de

avaliação de potencial mutagênico é carcinogénico de substâncias E aí o próximo teste sobre o copo falar é o teste formação de cometa Esse é um teste largamente utilizado no mundo inteiro e tem várias variações Então você tem a versão do teste de cometa in vitro que é a mais comum e mais recentemente a foi introduzida também a versão desse teste in vivo para o teste in vitro é utilizado a célula é cultivo de célula e esse teste é vai avaliar ocorrência de danos ao DNA qualquer dano ao DNA A que modifique o potencial de migração

da molécula de DNA em um campo eletroforético por exemplo quebras na fita dupla ou na na vida simples a a classificação por causa de oxidação na fita do DNA ligação do DNA proteínas do DNA drogas que são aqui a formação de adultos de DNA A alterações no processo de reparo que vão manter é esse tipo de dano ao DNA na na fita dupla de DNA que que você quer avaliar e também a esse é um teste que tem mesmo in vitro alguns tipos de variação mas de uma maneira geral Esse é um teste aqui onde

normalmente a gente utiliza um nd5 por grupo com 3 doses diferentes para ser avaliadas e avalia alteração da migração desses fragmentos do DNA em um campo eletroforético e e como pode ser observado aqui na figura a se nessa primeira parte nós temos a o que seria o nosso controle negativo não exposto a substância química que a gente quer avaliar e aí a gente observa um ponto único indicativo de um DNA íntegro que não sofreu nenhum tipo de lesão então ele migra de uma forma única conjunta no campo eletroforético na imagem que representa a o DNA

que sofreram lesão pela substância que a gente quer avaliar nós podemos observar a formação de uma calda logo após a parte principal da molécula de DNA essa calda que é formada e é por isso que esse teste tem esse nome porque a imagem que se observa microscópio é similar a de um cometa essa calda é a característica O que é característica na verdade de a pequenos fragmentos de da fita de DNA que sofreram a lesões então a migração dela por sempre pode ser em pedaços menores da fita fica alterada quando comparada com a molécula maior

tá o tempo a velocidade de migração é diferente e aí nós temos softwares que conseguem avaliar o comprimento a dessa calda formada e fazer uma análise estatística comparativa para os grupos controle negativo e controle positivo e então mostrar para a gente a existência dos danos à essa molécula de DNA é o último teste de curta duração para avaliação de alterações no DNA é o teste de micronúcleo esse teste avalia a ocorrência de alterações cromossomais em Vivo e são alterações que podem ocorrer a partir da interrupção no processo de replicação do DNA do dano direto os

cromossomos e que vão levar consequentemente a uma alteração na distribuição do material genético entre o núcleo das células filhas depois que elas passam pelo processo de divisão então quando isso ocorre o material genético que não é incorporado no núcleo das células filhas após o processo de divisão ele forma o seu próprio micronúcleo e o que é visível ao microscópio que é o que tá apontado aqui pelas setas na imagem inferior aqui do slide e para esse ensaio Os animais são expostos a substâncias químicas EA frequência de Formação dessas células micro no criadas é que é

determinada depois de um período de tempo que você determinar para após exposição no seu ensaio esse ensaio ele precisa ser realizado em células que estão se dividindo e dão principalmente é comum e variar mos as células da medula óssea por esse motivo e assim como outros testes de curta duração esse teste vai fornecer para gente informações sobre a capacidade de promover mutações de uma determinada substância química mas não vai detectar a capacidade de promover o câncer assim como ele não é capaz de detectar a atividade de carcinógenos que atuem pelo mecanismo de ação não genotóxico

Oi tá na imagem a gente tem aqui ilustrações do cariótipo de três espécies completamente diferentes para vocês verem que é um teste que funciona bem independente da espécie que a gente estava olhando independente da complexidade do Genoma que se quer avaliar então não pede que vai avaliar essas alterações promoção promocionais e em relação ao teste de longa duração Eles foram desenvolvidos para se detectar ou para se identificar o potencial carcinogênico em Vivo tá E aí nós temos principalmente ou como principal teste para identificação desse potencial carcinogênico o ensaio crônico de dois anos mas também podem

ser feitos ensaios a um pouco mais curtos que são aqueles ensaios de mede o termo que vão buscar a formação tumoral em tecidos específicos utilizando modelos de animais que são susceptiveis a mais receptíveis em determinados órgãos em determinados tecidos para tentar reduzir um pouco o tempo de execução destes ensaios mas eu vou explicar para vocês um pouquinho sobre o ensaio crônico dois anos que é o principal o raio de longa duração primeira coisa que tem que se ter em mente é que a gente não faz geralmente OB ensaio crônico antes de se fazer os ensaios

de curta duração o que é que a gente não faz ele antes de fazer os ensaios de curta duração por ser um ensaio longo e consequentemente um ensaio mais caro é preciso é desejável que se tenha um mínimo de informação sobre o potencial carcinogênico da substância em questão antes de se entregar tanto tempo e tanto dinheiro a na execução desse Bill ensaio crônico e outra coisa além dos ensaios de curta duração é que é comum a gente realizar um ensaio curto para determinação da mtd que vai ser a máxima dose tolerável para ser utilizada nesse

Bill ensaio crônico esse ensaio curto Henrique para determinação da entender a geralmente o ensaio de 90 dias para determinar se adoro Qual a dose mais alta que não vai matar os animais e consequentemente que vai poder ser utilizada em um ensaio de dois anos esse é um ensaio bastante questionável porque ele mostra para gente ou ele sugere para a gente a utilização de uma dose muito alta e muito acima daquela dose que seria utilizada na prática de consumo da substância ou do fármaco ou do alimento do que se quer avaliar e a gente transporta para

o consumo humano determinada as doses que se vão utilizar nesse Bill ensaio crônico é nós fazemos a divisão dos animais normalmente a gente utiliza a senha animais 50 fêmeas e 50 machos mais a senha animais controle dividido da mesma maneira e animais com oito semanas de vida e que a gente vai testar praticamente até o fim da vida do animal porque eu vim ensaio crônico de dois anos justamente porque a vida média de um roedor é de 2 anos e a gente pode utilizar diferentes vias de administração só que as vias mais comuns são a

via oral por gavagem ou a introdução da substância na dieta ou a inalação da substância nas caixas de inalação próprias para isso E durante todo esse período a gente vai realizar uma monitorização desse animal a gente vai avaliar se o consumo de alimento para sendo mantido se o peso corpóreo tá variando da mesma forma produto dos animais entre o grupo controle e no grupo teste se existe alguma alteração Clínica observava veu a e que ser esteja acontecendo de maneira diferente entre os animais e no final desse período de dois anos a gente vai realizar necropsia

para determinar o número de neoplasias a localização EA patologia Então nesse nesse momento a trabalhar todo o animal para realmente determinar a capacidade de indução de câncer seja lá em que tecido for e é normalmente para se concluir uma ensaio carcinogênico de uma maneira completa a gente tem uma mínimo aí presa quatro anos para obtenção de uma resposta conclusiva é muito raro um laboratório sozinho consegui realizar todos os testes que são necessários para obtenção de uma resposta tanto isso é uma verdade que a iarc naquelas monografias que eu mostrei para vocês lá na aula teórica

utiliza ou faz um compilado de vários estudos realizados por grupos diferentes para uma mesma substância para realmente eu consegui a enquadrar essa substância em uma daquelas categorias e se você for avaliar os custos totais para se realizar esse somos carcinogênicos de maneira adequada a gente vai perceber que eles vão normalmente ultrapassar um milhão de dólares Então são estudos caros e são estudos demoradas e que exigem pessoal qualificado exigem uma estrutura relacionada à bem montada ainda assim é possível a gente obter resultados falso-positivos a e nós sabemos que devido a ao design mesmo dos ensaios principalmente

dos bioensaios crônicos avaliação de risco quantitativa geralmente exagerada por causa da utilização de doses mais altas em animais quando comparadas a dose de uso em humanos a em casos positivos é nós ainda precisamos realizar os testes para identificar o possível mecanismo de ação ou então a gente não libera essa substância para uso Ok bom a gente tá encerrando por aqui essa parte sobre os testes para avaliação de potencial carcinogênico eu espero ter iluminado um pouquinho o conhecimento de vocês acerca desse tempo até mais