Aulas 17 e 18 noturno

Olá meu nome é Débora Sou professora da faculdade de farmácia da UFMG do departamento de produtos farmacêuticos essa é uma aula da disciplina tópicos em ciências farmacêuticas C biotecnologia farmacêutica medicamentos biológicos esta aula está protegida pela lei de direitos autorais Segue o documento de advertência legal o qual já foi apresentado para todos os alunos gostaria de destacar que entre outras ações que estão escritas um documento de advertência legal é proibido copiar e divulgar qualquer tipo de conteúdo desta aula bom o que nós vimos na nossa disciplina até agora nós verificamos como que podemos fazer o

desenvolvimento da linhagem celular então a gente pode utilizar por exemplo linhagens celulares de mamífero nós podemos utilizar bactérias leveduras que são modificadas geneticamente de forma que elas contenham o gene que codifica a Bi molécula alvo o nosso biofarmaco bom após o desenvolvimento da linhagem celular a gente tem aquela etapa de criação de desenvolvimento do banco de células mestre banco de células de trabalho em seguida com essas células O que que a gente vai fazer então o processo de cultivo celular quando a gente fala de células de mamífero ou processo de fermentação quando falamos de bactérias

de leveduras a partir do cultivo celular o que que a gente vai obter a gente vai obter o meio de cultivo meio cultivado né que é o meio que contém as células e nesse e nesse meio a gente vai ter o biofármaco o biofármaco ele vai poder estar presente ou diretamente no meio de cultivo no meio líquido ou ele pode estar presente dentro da célula nós vamos ver isso hoje bom com esse meio de cultivo com o meio cultivado qual que vai ser a próxima etapa então que precisamos fazer para que a gente consiga obter

a nossa proteína Alva a próxima etapa consiste na recuperação e na Purificação da biomolécula áv que é o processo downstream em artigos a gente vai encontrar esse termo de processamento downstream que consiste nas etapas de recuperação e Purificação da biomolécula alva Qual que é o objetivo dessa etapa o grande objetivo é que a gente consiga obter a biomolécula com o grau de Pureza e formulação requeridos a partir do meio no qual ela foi produzida então aqui a gente tem o biorreator em que a gente vai fazer o cultivo celular a partir disso aqui nesse meio

seja no meio ou seja dentro da célula a gente vai ter a proteína alvo aqui no nosso exemplo é a eritropoietina a a estrutura tridimensional da eritropoetina tá representada em verde a superfície dessa macromolécula em amarelo e aqui essas esferas Verdes são as cadeias de carboidratos que são ligadas na eritropoietina ela apresenta três cadeias aqui de carboidratos e esse daqui em azul é a estrutura tridimensional do receptor que é presente na superfície da célula progenitora na medula óssea E aí a partir dessa interação é que vai ocorrer a diferenciação em glóbulos vermelhos bom então a

eritropoietina ela vai ter que ser purificada a partir do eh do do biorreator né a partir do meio de cultivo do biorreator e ela também vai ter que ser colocada em uma formulação adequada para que el ela tem para que ela consiga eh manter a sua atividade biológica a sua estrutura para que ela seja e fique estável e possa ser utilizada como biofármaco para cada biomolécula a biomolécula que a gente fala aqui é o nosso insumo farmacêutico ativo que é o biofármaco bom para cada tipo de biomolécula para cada proteína que a gente vai utilizar

como biofármaco a gente tem que ter uma estratégia para isolamento e Purificação Ou seja a gente não tem uma estratégia Geral de purificação e de recuperação que pode ser aplicada para qualquer biofármaco então isso vai ter que ser desenvolvido então primeiro a gente tem a escala eh de laboratório em que todo o processo vai ser eh estudado até chegar em um processo que seja eficiente para Purificação daquela biomolécula E aí a partir dessa escala Laboratorial isso vai passar para uma escala piloto e depois para uma escala industrial e nesse processo é a ajustes vão precisar

ser feitos então isso aí sempre vai e vai vai ocorrer normalmente vai ocorrer né esses ajustes quando a gente passa de uma escala para outra então a gente tem que definir uma estratégia que seja eficiente para cada proteína que a gente quer purificar Então se a gente vai fazer a purificação da eritropoietina é diferente do processo que é utilizado para Purificação da insulina que é diferente da estratégia de purificação do adalimumab Então as estratégias são diferentes ok não tem um procedimento geral quando a gente pensa no desenvolvimento dessa estratégia Quais são os pontos que precisamos

considerar precisamos então analisar as características da proteína então se a proteína é um anticorpo se a proteína é uma glicoproteína aí só fazendo um parênteses os anticorpos são glicoproteínas mas como eles são uma classe eh bastante importante a gente sempre eh costuma falar anticorpo mas aí a gente sempre tem que lembrar que os anticorpos são glicoproteínas mas são glicoproteínas que são capazes de interagir especificamente com um antígeno então eh a gente tem que saber se é uma um anticorpo se é uma glicoproteína né mas não é um anticorpo eh a gente tem que ter essas

informações porque a partir dessas informações a gente já vai conseguir eh propor determinadas estratégias por exemplo se é um anticorpo ele é capaz de interagir com o antígeno então a gente pode pensar em uma cromatografia em que a gente aplique a interação do anticorpo com o antígeno E aí a gente consegue facilitar o processo de purificação eh outra questão é o são os sistemas de expressão então por exemplo se a gente pensa numa expressão em bactéria geralmente a proteína ela vai ficar presente dentro da célula se ela vai ficar presente dentro da célula a gente

vai precisar de acrescentar uma etapa de rompimento celular agora se a gente pensa em células de mamífero na grande maioria das vezes a proteína ela já vai ser Export diretamente pro meio de cultivo então a gente não vai precisar de lisar a célula Então a gente tem que avaliar isso também componentes do meio de cultivo por exemplo eh eu falei com vocês que era comum a utilização de soro soro animal como soro bovino isso agora eh já tá tendo eh uma grande diminuição no uso né as agências regulatórias já recomendam que não seja mais utilizado

soro bovino e a gente já tem meios de cultivo livres de soro mas assim eu só queria dar o Us como exemplo porque no soro bovino a gente tem uma grande quantidade de Albumina E aí a Albumina vai atuar como uma impureza como um contaminante se a gente sabe disso a gente já pode implementar estratégias para poder eliminar a Albumina outros fatores que precisamos considerar são os seguintes as principais impurezas a serem eliminadas né como o exemplo que eu acabei de dar eh e o uso final da biomolécula Alfa Isso aqui vai ser bastante importante

a gente tá falando aqui sobre biofar F Mas é interessante também e informar o seguinte que essas Eh esses procedimentos de purificação eles são utilizados eles podem ser utilizados para purificação de proteínas que vão ter outras finalidades então por exemplo proteínas que vão ser utilizadas em estudos estruturais elas também têm que ser purificadas E aí eh nesse caso o que que acontece a pureza a ser alcançada é um item muito importante quando a gente pensa em fármacos quando a gente vai ter a aplicação terapêutica da proteína a pureza do produto vai ser sempre primordial eh

principalmente por quando a gente pensa em biofármacos A grande maioria vai ser utilizada eh por via de administração par interal então o grau de Pureza tem que ser elevado e na maioria das vezes são requeridos graus de Pureza acima de 99,9 por. a gente não pode ter a presença de contaminante Antes quando a gente pensa em biofármacos e os o e o grau de Pureza ele é elevado e tem que ser principalmente se a gente considerar que se a gente lembrar que vai ser uso para interal Então isso é extremamente importante agora quando a gente

pensa por exemplo em proteínas que vão ser utilizadas para ensaios estruturais eh anteriormente eu mostrei para vocês a estrutura da eritropoietina que é a estrutura tridimensional da proteína aqui a gente tem a estrutura tridimensional de uma outra proteína que é uma proteína do vírus sarx cov2 que é o novo coronavírus bom mas voltando aqui na eritropoietina aquela estrutura que eu mostrei para vocês ela foi obtida através de uma técnica experimental e para isso aquela proteína ela teve que ser produzida e obtida e em uma quantidade eh relativamente grande eu digo relativamente por é uma quantidade

que a gente utiliza para fazer os ensaios estruturais Agora se a gente pensar na quantidade dessa proteína que é produzida industrialmente como biofármaco aí a quantidade é muito maior eh eu digo uma quantidade relativamente grande porque se a gente pensa por exemplo em proteínas que vão ser obtidas para outros tipos de ensaio como ensaios enzimáticos aí a gente precisa de uma menor quantidade de proteína comparando com a quantidade necessária para ensaios eh estruturais para determinação da estrutura tridimensional da proteína bom então aqui eh eu coloquei um exemplo para você de uma proteína do sarscov 2

que é M Pro é uma protease que é presente nesse vírus e aí a gente pode a gente essa estrutura que eu tô mostrando aqui para vocês ela foi obtida a partir de uma técnica experimental eh E como que essa proteína foi produzida ela foi produzida em ecole então o gene que codifica essa proteína foi inserido na ecole a ecole produziu essa proteína E aí foi preciso purificar essa proteína bom no caso dessa dessa enzima A gente tem que saber qual que é a finalidade Qual que é o uso nesse uso eh que eu estou

falando com vocês de determinação da estrutura tridimensional a gente também precisa de um grau de Pureza elevado mas esse grau de Pureza ele não é tão elevado quanto a gente pensa na produção de biofármacos aqui a gente necessita de um grau de Pureza acima de 95% e quando a gente pensa por exemplo em ensaios enzimáticos o grau de Pureza ele pode ser menor ele pode ser entre 80 e 90% E aí então o que eu queria destacar para vocês é que a finalidade eh da biomolécula é muito importante pra gente saber o tanto de etapas

que a gente vai ter que realizar durante esse processo de recuperação e Purificação para que a gente consiga atingir o grau de Pureza adequado Apesar de que cada biomolécula vai ter um processo de purificação específico existem alguns pontos que são comuns ao estabelecimento ou ao desenvolvimento de qualquer processo de purificação de uma biomolécula de Ah no nosso caso aqui um biofármaco bom Quais são esses pontos que a gente tem que sempre analisar a gente tem que sempre utilizar métodos de separação que sejam baseados em princípios físicos diferentes Então isso é extremamente importante no processo a

gente tem que inserir por exemplo uma filtração a gente tem que inserir uma cromatografia quando a gente pensa em cromatografia a gente vai utilizar cromatografias que sejam basead em princípios diferentes então por exemplo uma cromatografia de afinidade uma cromatografia de tro iônica isso é extremamente importante por quê Porque aí a gente vai conseguir eliminar compostos que são diferentes quando a gente tem o meio de cultivo o meio cultivado que é a suspensão celular a gente tem uma grande quantidade de elementos presentes ali quando a gente tem a Lisa das células seja a Lisa das células

porque a proteína tá presente dentro da célula ou no processo mesmo de cultivo celular algumas células elas vão acabar se rompendo isso vai fazer com que o conteúdo intracelular seja seja todo liberado no meio fazendo com que a gente tenha eh uma grande quantidade de DNA de organelas de proteínas de carboidratos todos esses elementos eles vão ter que ser eliminados de forma que a gente consiga obter somente a nossa proteína no final e aí se a gente utilizar métodos que se que baseiam em princípios físicos diferentes a gente tem uma maior chance de eliminar os

diversos componentes as diversas impurezas que estarão presentes no nosso meio bom e é interessante também que a gente utilize métodos que explorem as maiores diferenças entre a proteína Alva e as impurezas é é muito interessante quando a gente consegue estabelecer Quais são as as as principais impurezas né E que a gente conheça as características dessas impurezas porque aí a gente consegue propor métodos que vão eh conseguir separar de forma mais eficiente porque a gente pode utilizar métodos que se baseiam em princípios físicos que conseguem eh separar proteínas com aquelas características diferentes que a gente consegue

determinar Além disso é interessante que a gente faça a remoção dos contaminantes menos relacionados ao produto ou aqueles presentes maior quantidade o mais cedo possível então assim eh na no no na suspensão celular a gente vai ter uma grande quantidade de elementos como falei quando a gente pensa nos lipídios nos carboidratos são elementos que são diferentes DNA eles são eh bastante diferentes da nossa proteína então nas primeiras etapas que a gente vai ter do processo de recuperação e Purificação a gente Visa eliminar principalmente esses componentes E aí depois a gente começa a eliminar os componentes

que são eh estruturalmente mais similares com o nosso produto e uma outra eh estratégia que a a gente sempre considera é projetar a etapa mais dispendiosa para o final por quê quando a gente pega o meio de cultivo o meio cultivado ele apresenta um grande volume a medida em que a gente vai começando a realizar as etapas de recuperação e Purificação a gente diminui esse volume então a gente eh diminui e ao mesmo tempo eh normalmente a gente tem uma Concentração da proteína mas o volume Total ele é de diminuído de forma que a etapa

que seja mais cara é melhor que ela esteja no final porque aí o volume que a gente vai aplicar nessa etapa já vai ser um volume mais reduzido Aqui nós temos um esquema Geral de purificação de um produto biotecnológico como um biofarmaco bom eh então aqui eh no biorreator O que que a gente tem a gente tem o meio cultivado que é uma suspensão de células essa suspensão de células O que que a gente tem que fazer Qual que é a primeira etapa que ela vai passar após o cultivo no biorreator a primeira etapa consiste

em um processo de separação sólido líquido que é denominado clarificação Por que clarificação nessa etapa a gente tem a separação das células do Meio líquido então quando a gente tem uma suspensão em que a gente tem partículas sólidas no meio esse meio ele fica Tur quando a gente faz essa Separação das células e do Meio ou seja do sólido e do líquido a gente tem um meio um líquido que fica menos Turvo por isso que esse processo é denominado clarificação e em seguida O que que a gente tem que pensar bom e a gente tem

agora as células e a gente tem o meio clarificado O que que a gente vai utilizar as células ou o meio bom se as proteínas elas são produzidas e permanecem dentro da célula a proteína de interesse se ela permanece dentro da célula a gente vai precisar das células então o nosso produto é intracelular se o nosso produto é produzido e é secretado para o meio a gente vai precisar do Meio líquido clarificado que também é denominado sobrenadante então o nosso produto a gente pode denominar como um produto extracelular no caso e de produtos de proteínas

recombinantes que são produzidas em Eco que é principal bactéria que é utilizada na indústria biofarmacêutica eh as proteínas elas as proteínas combinantes elas vão ficar presentes principalmente no citoplasma então elas não vão ser secretadas na grande maioria das vezes elas vão permanecer no citoplasma aqui a gente tem um esquema de um organismo procarioto Então as proteínas recombinantes elas permanecem principalmente aqui no citoplasma elas não são secretadas nesse caso a gente vai ter que ter etapas adicionais para que a gente consiga purificar a macromolécula de interesse em que que consistem essas etapas adicionais consistem no rompimento

da célula Então a gente tem que promover a Lise da membrana plasm da parede celular da membrana plasmática para que a a proteína que tá presente aqui seja liberada para uma solução quando a gente pensa e em cultivo em células animais na grande maioria das vezes as proteínas elas vão ser secretadas então elas já vão ficar presentes no meio de cultivo a gente não vai precisar alisar a célula e aí o que que vocês acham Qual o processo de purificação que vai ser mais complexo a purificação de um produto intracelular ou a purificação de um

produto extracelular então o processo mais complexo é a purificação de um produto intracelular por quê quando a gente promover a alise das células a gente vai ter a liberação tanto da proteína de interesse quanto de várias outras proteínas de lipídios de carboidratos e a gente tem também a liberação do material genético então a a o processo de purificação ele vai ser mais complexo quando a gente pensa nos produtos extracelulares no cultivo de células animais por exemplo a gente sempre vai ter uma taxa das células que vão acabar morrendo e o conteúdo eh intracelular vai ser

liberado também mas aí a taxa é muito menor porque a grande maioria das células elas vão ficar eh presentes sem ser sem estarem mortas né sem ser lisadas uma pequena parcela vai ser lisada e vai liberar o conteúdo para o meio mas isso é em pequena parcela e de forma que o processo de purificação vai ser mais simples porque a proteína de interesse já tá presente no meio a gente não vai ter que romper a célula consequentemente não vai ser liberado todo esse conteúdo celular aqui bom pensando então aqui no produto intracelular após a gente

ter as células qual que vai ser a próxima etapa o rompimento dessas células Então essas células que são obtidas por esse processo de clarificação elas vão ser rusas em um tampão uma solução tampão E aí a partir disso a gente vai realizar o rompimento celular depois desse rompimento celular a gente vai obter um meio no qual a gente tem a presença da proteína de interesse a gente tem a presença também de todo o conteúdo intracelular e a presença dos debris celulares de forma que vai ser necessária uma nova etapa de separação sólido líquido e aí

nesse caso qual que vai ser o objetivo vai ser a remoção dos debris celulares a gente tem a remoção e em seguida a gente vai utilizar o quê o meio líquido clarificado o sobrenadante no qual vai estar presente a proteína de interesse bom então aqui no caso dos produtos extracelulares e a gente tem também né a a a utilização do nante do Meio líquido clarificado quais são as próximas etapas então que a gente vai realizar com esse sobrenadante no qual está presente o nosso biofar a gente tem então as etapas de recuperação que também pode

ser chamada de isolamento primário Purificação que pode ser chamada de purificação intermediária nesse caso quando a gente pensa nessa ordem aqui polimento ou Purificação final e a formulação e o invas bom essas duas etapas aqui elas consistem em qu qu na verdade eh qual que é o objetivo dessas duas primeiras etapas eh elas eh objetivam eliminar impurezas que apresentam características físico-químicas bem diferentes da proteína de interesse então por exemplo a gente vai vai conseguir fazer a eliminação eh de ácido nucleico a eliminação de carboidrato de lipídio a gente também pode conseguir fazer a eliminação de

proteínas que tenham características mais diferentes da nossa proteína de interesse a etapa seguinte que é a etapa Não na verdade gente é nessa etapa aqui de purificação intermediária a gente já consegue fazer a eliminação de proteínas que apresentam características mais diferentes da nossa sim na etap de polimento ou Purificação final é que a gente vai eliminar aques prodos que sdos com a nossa proteína então por exemplo proteínas que apresentam características muito similares à nossa proteína ou então e agregados da nossa proteína a gente vai conseguir eliminar principalmente nessa etapa aqui de polimento ou de purificação

final e em seguida que que a gente tem a gente tem a formulação que é a gente e colocar a proteína em uma solução que seja adequada né E pra administração e pra estabilidade dessa macromolécula e o invas bom agora a gente vai ver sobre os principais tipos de operações unitárias que são utilizadas o que que são as operações unitárias operações unitárias consistem nas etapas de um processo produtivo Então a gente vai ver eh inicialmente os principais tipos de operações unitárias que são utilizadas para o processo de separação sólido líquido que é denominado clarificação bom

um detalhe importante aqui é que cada uma dessas etapas que eu mostrei para vocês por exemplo aqui no caso de purificação purificação intermedi área Purificação final essa etapa ela pode ser constituída de várias operações unitárias então Eh dentro por exemplo de purificação intermediária a gente pode ter umas quatro operações unitárias ou mais alguns exemplos de operações unitárias que podem ser utilizadas para separação sólido líquido consistem na filtração e aí a filtração ela pode ser classificada em filtração convencional ação tangencial e centrifugação são alguns exemplos que são utilizados bom a filtração ela baseia-se na separação do

sólio dos líquidos em função do tamanho das partículas a centrifugação a essa separação ela é baseada no tamanho e também na densidade das partículas falando então da filtração a filtração ela baseia-se na passagem de uma suspensão através de um meio filtrante E aí a gente vai ter a tensão de determinadas partículas e a passagem do restante do meio a filtração ela pode ser denominada como convencional e tangencial qual que vai ser a diferença desses dois tipos de filtração na filtração convencional a alimentação Ou seja a entrada da suspensão de células ela ocorre na direção perpendicular

em relação ao meio filtrante então Aqui nós temos um esquema em que aqui a gente tem o meio meio filtrante por exemplo uma membrana e aqui a gente tem a entrada da suspensão de células Essa susão ela passa através da membrana no sentido perpendicular e a gente tem aplicação de uma pressão nesse meio está entrando fado nesse tipo de filtração o que que vai acontec a gente vai teri cont aqui n região daana deé e de meio e ISO faz com que a gente levando a formação de uma torta de filtração que é formada pelo

acúmulo aqui tanto de células quanto do meio e isso vai gerar uma maior resistência à filtração então a membrana que está presente aqui que é a membrana filtrante ela já gera uma resistência à filtração quando a gente tem a deposição de células que vai se acumulando a gente vai aumentar essa resistência então a resistência ela não vai ser devido somente à membrana que é o elemento filtrante ela vai ser também devido à presença desse acúmulo de células que é denominado torta de filtra ação já na filtração tangencial o que que acontece nesse caso a alimentação

da suspensão de células vai ocorrer na direção Paralela em relação ao meio filtrante então aqui nesse esquema a gente tem o meio filtrante que aqui é uma membrana e a passagem a alimentação ou a entrada da suspensão de células ela vai ocorrer na direção paralela à membrana de forma que a gente vai ter é uma diminuição desse acúmulo de células e de meio aqui nessa região da membrana isso vai então fazer com que a gente tenha um aumento da eficiência dessa filtração nesse caso da filtração tangencial a gente tem a passagem das moléculas aqui eh

as moléculas que passam através da membrana elas são obtidas nesse eh nesse fluido que é chamado de permeado e as células elas ficam presentes aqui mas elas não vão se acumular acaba ocorrendo um acúmulo mas é muito menor do que quando a gente compara com a filtração convencional então é a filtração tangencial que vai ser é o tipo de filtração que vai ser mais utilizado hoje ela é bem mais eficiente do que a filtração convencional E aí a gente consegue ter eh essa Separação das células e a obtenção apenas do sobrenadante aqui nessa região quando

a gente pensa na etapa eh de clarificação né a filtração tangencial Ela tanto pode ser utilizada para que a gente consiga fazer uma separação das células do meio e ela também pode ser utilizada quando a gente quer fazer por exemplo a separação de moléculas proteicas com tamanho diferente então a gente quer promover por exemplo uma Concentração da nossa proteína a gente também consegue fazer isso eh nesse caso a gente vai eh utilizar membranas que tem poros menores E aí a nossa proteína eh juntamente com com outras moléculas de tamanho parecido de tamanho similar elas vão

ficar retidas e outras eh proteínas elas podem passar de forma que a gente consegue ter uma etapa de purificação e ter também uma Concentração da nossa proteína Porque que a gente tem a passagem do meio e a gente consegue também concentrar então a filtração tangencial eh existem vários tipos a gente tem microfiltração ultrafiltração E aí a gente pode eh utilizar não somente para fazer essa separação inicial das células como também posteriormente nas próximas etapas para a concentração da biomolécula a gente também pode utilizar e como etapa de purificação também para que a gente elimine outras

moléculas do Meio isso vai depender do tamanho dos poros da membrana e a centrifugação que é o outro tipo de operação unitária que eu citei as células em suspensão elas vão naturalmente sedimentar por ação da gravidade E aí o que que acontece a gente pode utilizar a centrifugação na qual ocorre o estabelecimento de um campo gravitacional centrífugo para que a gente consiga acelerar esse processo de sedimentação e a gente consegue promover a separação do sólidos suspensos E aí para que a gente consiga esses sólidos eles precisam de apresentar uma densidade maior que a densidade do

líquido aqui a gente tem um ex de uma centrífuga que é uma centrífuga de discos que é utilizada em escala Industrial a gente tem aqui a entrada da suspensão celular as células elas vão ficar retidas a gente tem a aplicação de um campo centrífugo então e a centrífuga ela fica girando aplicando essa força centrífuga eh de forma que as células os sólidos eles vão ficar acumulando nessa região E aí eles podem ser coletados por aqui e o meio clarificando ele vai ser obtido através dessa região aqui nós temos um exemplo de um biorreator de padrão

Industrial é um biorreator de 2 l ele é um biorreator de bancada que é utilizado para escala Laboratorial mas ele pode ter uma ampliação de escala então o processo produtivo que é desenvolvido utilizando esse biorreator ele pode ser ampliado para uma escala piloto e para uma escala industrial esse exemplo que eu trouxe para vocês é da tese de doutorado da Luna Marina do laboratório de biologia estrutural e biotecnologia do icb aqui da UFMG então aqui é o início do processo produtivo no biorreator esse biorreator ele vai consistir na última etapa do processo de fermentação eh

antes disso então foi necessário fazer o inóculo das células em um meio de cultivo de menor volume para que as células recuperassem toda a capacidade metabólica E aí em seguida essas células elas foram acrescentadas no biorreator juntamente com o meio de cutio após alguns dias de fermentação a gente vê que a gente tem um aumento da eh a gente consegue visualizar aqui que o meio tá bem mais Turvo Então a gente tem uma densidade celular muito grande aqui no final do processo que ocorreu por alguns dias Qual que é a próxima etapa Então a gente

tem a suspensão celular e agora vai ser necessário fazer uma separação sólido líquido nesse caso a operação unitária que foi utilizada foi centrifugação e a centrífuga é uma centrífuga diferente da que eu mostrei anteriormente é uma centrífuga de escala Laboratorial em que são utilizadas garrafas então após a centrifugação o que a gente obtém é isso daqui então a gente tem aqui as células e aqui o meio clarificado nesse caso a proteína de interesse ela permaneceu dentro das células Então o que a gente vai utilizar aqui agora são as células Qual que é a próxima etapa

então que a gente tem que alizar a gente tem que promover agora o rompimento dessas células quando a gente promover bom a desculpa antes do rompimento das células a gente vai descartar esse meio porque a gente não vai utilizá-lo então ele vai ser descartado tomando todos os as medidas necessárias eh E essas células elas vão ser ressuspensão tampão após isso elas vão ser lisadas de forma que a proteína vai ficar presente agora no meio líquido então eh esse meio a gente vai ter tanto a presença de proteínas a gente vai ter a presença de debr

celulares Então tem que ser realizada uma outra etapa de separação sólido líquido então pode ser realizada uma outra centrifugação E aí após essa segunda centrifugação a gente vai utiliz agora o sobrenadante então aqui tá o exemplo desse segundo sobrenadante no qual há a presença DAE de interesse então essae ela vai segir para as próximas etapas Aqui nós temos o exemplo da centrífuga que eu falei para vocês de escala Laboratorial então aqui são utilizados tubos e com volume de 50 ml Aqui já são tubos maiores no caso dessa centrífuga ela eh pode utilizar garrafas de até

2.000 l então a capacidade dela é bem maior no caso da garrafa que eu mostrei para vocês anteriormente para centrífuga é uma garrafa que pode ser utilizada nesse tipo de centrífuga e ela apresenta e 200 250 ml maior do que esses tubos que estão mostrados aqui mas a gente tem e adaptadores que a gente pode utilizar para eh utilizar aquelas garrafas que eu mostrei para vocês Bom pensando então agora nas principais operações unitárias que a gente vai utilizar para fazer o rompimento celular essas operações consistem em homogeneização ultrassom moagem em Moinho de bolas rompimento químico

ou enzimático então todos esses tipos de operações unitárias podem ser utilizadas para promover o rompimento de células essas três primeiras são eh rompimento celulares que baseiam-se no cisalhamento então Eh esse cisalhamento consiste na aplicação de forças que vão levar ao rompimento das células e o rompimento químico ou enzimático é utilizando então enzimas ou produtos químicos que podem promover e Hidrólise solubilização ou desidratação de moléculas que compõem tanto a parede ou a membrana celular o principal tipo de operação unitária que a gente vai utilizar em escala Industrial é a homogeneização os homogeneizadores são equipamentos como esse

esse daqui é um homogeneizador de escala Laboratorial esses homogeneizadores eles apresentam pistões que vão aplicar altas pressões à suspensão celular então a suspensão celular ela vai ser aplicada aqui e a gente vai ter a aplicação de pressões que vão forçar a passagem dessa suspensão através de um orifício Muito estreito seguido da colisão contra uma superfície em uma câmara sobre baixa pressão dessa forma tanto Devido à queda de pressão nessa câmera sob baixa pressão mais o impacto a gente vai conseguir promover o rompimento das células sem danificar as proteínas Então esse daqui é um exemplo a

amostra ela vai ser aplicada aqui eh e aí ela vai passar por todos esses dispositivos que eu falei com vocês e ela vai ser obtida através eh aqui em um determinado recipiente que a gente acrescentar quando a gente trabalha com proteína é importante que esse sistema seja mantido sob temperaturas mais baixas então Eh exe tem adaptadores que a gente pode eh acrescentar para que essa solução essa suspensão que está passando aqui ela fique em uma temperatura mais baixa e em escala Laboratorial a gente também costuma manter o recipiente no Qual a proteína vai ser obtida

em temperaturas mais baixas então a gente pode colocar o recipiente por exemplo em uma caixa com gelo para que a gente mantenha eh uma um ambiente mais adequado para armazenamento da proteína aqui a gente tem exemplos de células de leveduras antes de passar pelo homogeneizador e após a passagem pelo homogeneizador a gente consegue ver as células todas lisadas com essa amostra aqui agora pessoal é que a gente tem que fazer novamente aquela etapa de separação sólido líquido que eu falei com vocês e aí a gente vai obter o sobrenadante então quando a gente pensa em

bactérias é nessa etapa que a gente obteve esse segundo sobrenadante que a gente vai ter a proteína presente em uma solução sem a presença dos debis celulares e sem a presença das células quando a gente fala é de células de mamífero as proteínas na maioria das vezes elas já vão ser eh secretadas diretamente pro meio de cultivo então a gente não precisa dessa etapa de rompimento celular Então pessoal ok a gente viu até agora as etapas que a gente conseguiu eh as etapas que a gente precisa realizar para que a gente chegue no sobrenadante então

tanto o sobrenadante que foi proveniente a partir de um produto que era intracelular como o sobrenadante que foi proveniente de um produto que já era extracelular bom a partir desse sobrenadante então quais são as próximas etapas as próximas etapas elas vão consistir nos processos de recuperação de purificação intermediária de purificação final nessas etapas aqui o principal tipo e não na verdade nessa primeira etapa aqui que é a etapa de recuperação e isolamento primário nessa etapa eh ela vai ser feita principalmente para que a gente consiga realizar um aumento da concentração da nossa proteína porque a

gente pode ter é proveniente do do desse sobrenadante um volume muito grande então a gente pode realizar uma primeira etapa que promova a concentração da nossa proteína Então essa etapa ela pode ser realizada por exemplo através de uma filtração para que a gente consiga aumentar essa quantidade de proteína as etapas seguintes que consistem na Purificação Purificação intermediária Purificação final o principal tipo de operação unitária que a gente vai utilizar aqui consiste na cromatografia então aqui a gente vai ter e cromatografia sendo que na Purificação intermediária o objetivo da cromatografia vai ser eliminar A grande maioria

das impurezas A grande maioria dos contaminantes quando a gente pensa na Purificação final que é o polimento a gente vai eliminar eh impurezas que são mais relacionadas com o nosso produto então tanto a gente pode ter proteínas que apresentam características físicoquímicas muito semelhantes como a gente pode ter também eh compostos que são por exemplo agregados da nossa proteína que às vezes a gente não consegue eliminar antes a gente vai eliminar nessa etapa de polimento uma outra característica que vai ser bastante importante eh nessas etapas de purificação intermediária Purificação final é a acrescentar etapas que promovam

a remoção de vírus porque quando a gente trabalha principalmente com as células de mamífero a gente pode ter a contaminação viral E aí é essencial que a gente acrescente pelo menos duas etapas que vão promover a eliminação de vírus a remoção de vírus e essas etapas de remoção de vírus Elas têm que ser validadas ou seja tem que ser provado que aquela etapa realmente é eficiente para eliminação dos vírus Então isso é essencial em um processo produtivo de biofármacos eh quando a gente pensa por exemplo nas células bacterianas em que a gente tem aquela camada

externa eh de lipopolissacarídeos que consistem nas endotoxinas a gente tem que ter etapas também para que a gente promova a eliminação dessas endotoxinas da mesma forma a gente tem que ter uma validação Ou seja a gente tem que provar que essas endotoxinas elas foram eliminadas na próxima aula então pessoal a gente vai ver os principais tipos de cromatografia que podem ser utilizados e eh a gente também vai ver alguns exemplos eh de esquemas né de processos produtivos de biofármacos n