[Música] Olá pessoal como vocês estão acompanhando aí nossas aulas de biotecnologia e enzimologia sejam muito bem-vindos a nossa aula 4 da unidade 1 Nesta aula nós estaremos Estudando um pouco mais sobre a tecnologia do DNA recombinante em relação aos exemplos de vetores para clonagem que vocês viram que é um conteúdo muito importante como base para estudarmos os outros conteúdos e também em relação as características desses materiais então Depois desses organismos desses agentes biológicos que vão ser a partir de uma recombinação de um gene de uma de um organismo diferente então Nesta aula nós vamos estar
estudando sobre esses vetores para clonagem gênica e a introdução do DNA que ocorre nas células vivas Então os vetores para clonagem gênica O que são esses vetores né Então vão ser moléculas de DNA capazes de se auto replicar dentro de uma célula lembra que nós vimos na aula passada que precisa de um vetor que é como se fosse um veículo que vai levar o DNA daquele outro material daquele outro organismo daquele fragmento que foi lá cortado de um outro organismo vivo e vai levar agora para dentro de uma outra célula para que ela passe agora
a se replicar com essa característica mas precisa de um veículo para encaminhar esse fragmento de interesse e quem vai ser o vetor de clonagem então a metodologia da clonagem de um fragmento de DNA primeiramente é na escolha de um vetor essa escolha de Vetor é muito importante porque ele que vai ligar a molécula lá do material genético aqui a gente observa como nós já vimos na aula anterior também aqui nós temos um vetor o genecer clonado né o gênero de interesse abre o vetor primeiro tem lá enzima de restrição vocês estão lembrado quem é enzima
de restrição a enzima que vai lá no gene de interesse faz aquele corte o fragmento e depois corta aquela extremidade vai ligar agora ao vetor que nós temos o vetor aberto e aquele fragmento de interesse ele vai ser ligado ao vetor lembra lá quem que liga DNA ligase Olha que interessante essa essa tudo essa característica por meio da biotecnologia recombinando agora a gente tem aqui ó um DNA recombinado a gente tem junto nesse vetor um fragmento de interesse e os componentes de um vetor de clonagem gênica primeiramente importante conhecer a origem de replicação que é
a sequência que permite a replicação do vetor nas células hospedeiras então é importante conhecer essa característica da replicação do vetor os marcadores de seleção Quais são os genes que vai conferir a resistência antibióticos porque geralmente são plasmídeos bacterianos então é importante conhecer geralmente no meio é aplicado antibiótico para evitar outros tipos de contaminações que vai permitir então identificar células que incorporaram ao vetor então é muito importante conhecer esse Gene de resistência também Cite os de clonagem local onde o DNA de interesse pode ser inserido e geralmente apresentam sítios de restrição específicos que nós vamos estar
aqui observando também e na escolha de um vetor quais são os tipos de vetores que existem vetores de bacteriofagos vetores pelas midiais que geralmente são de bactérias como nós vimos lá da escrita Coli que é o ecore vetores virais vetores cosmídeos que tem aqui a parte cos né ao invés de plasmadiais e vetores cromossômicos os plasmidiais são geralmente os mais utilizados principalmente para pequenos fragmentos de DNA já os vetores cosmídeos cromossômicos são utilizados para fragmentos mais grandes maiores né de DNA então eles acabam não sendo muito utilizados a gente observa aqui nessa imagem o vetor
mas o fragmento do DNA de interesse realizada clivagem tem o DNA recombinante e agora ocorre a replicação do DNA recombinante na célula ho spedeira aqui nós vemos a característica Então já do vetor selecionado aqui é uma representação do plasmídeo DNA recombinante também como nós já vimos mais uma melhor forma para poder ilustrar então vendo aqui a fita dupla hélice né da estrutura do DNA que é desse outro organismo de interesse que que vai acontecer ele tem lá o vetor plasmidial e essa parte aqui ó que a gente vê em vermelho é onde foi feita a
inserção do DNA de um outro agente de interesse de um fragmento de interesse depois que constituiu agora a gente tem desse vetor plasmidial mais o DNA que foi inserido nós temos agora um DNA recombinante esse DNA recombinante ele vai ser lá inserido como nós vimos naquele na outra aula dentro de uma molécula de interesse e assim ela vai se multiplicar em 2 4 6 e assim por diante para obter agora essas células com essas características aqui é um exemplo de uma aplicação do cosmídeo para fazer então essa no caso da escolha do vetor utilizando um
cosmídeo para fazer essa clonagem primeiramente então é feito uma linearização do lado DNA é aberto então aqui com essa enzima Ban depois observa-se os fragmentos de DNA de interesse que é feito então lá obtido com as enzimas de restrição depois é feito então a junção junto com o DNA ligase aqui a gente observa o empacotamento in vitro nas várias regiões aqui ó cosmídeo cosmídeo e aqui a ampr depois observamos aqui as extremidades do cosmídeo a forma linear e aqui a calda da cabeça e o material que vai ser inserido dentro da célula aqui do cro
mossomo bacteriano então aqui é um exemplo agora que essa escrita colhe aqui é colhe a bactéria ela passa a ter esse cosmídeo aqui no interior e passa a se replicar e assim multiplicar com essas características da célula quando ocorre a introdução do DNA então em células vivas o que que vai ocorrer primeiramente escolha eu lá o fragmento de interesse fez a com a DNA ligase ligou lá no vetor agora eu tenho o DNA recombinante como nós vimos com aquele gene de interesse quando vai inserir dentro da outra célula por exemplo uma célula bacteriana é a
etapa que ocorre a transformação bacteriana porque essa bactéria passa a ter agora um gene de interesse diferente que veio lá de uma outra espécie e essa transformação é o que é o processo em si de introduzir o DNA dentro lá da bactéria como que vai ocorrer essa inserção como que ocorre essa inserção do DNA pode ser pela utilização de choque térmico ou eletroporação o choque térmico é a aplicação de temperatura geralmente aplica uma temperatura alta e depois faz um resfriamento nessa diferença de temperatura vai ocorrer a abertura da membrana da bactéria ele é abertura da
célula Para que ocorra a entrada do material do DNA de interesse a eletroporação o nome já diz aqui elétron ele vem a partir do meio de uma corrente elétrica que vai mudar a polarização da célula bacteriana permitir abrir a membrana e assim poder entrar esse DNA recombinante outra etapa é a transfecção que a introdução de DNA em células de mamíferos que vai no caso então pode ser utilizado vetores virais ou não virais então aqui a gente vê ó em bactérias é transformação bacteriana células de mamíferos transfecção e aqui um ponto importante que eu queria mencionar
com vocês também é o uso da tecnologia crispi cas 9 essa tecnologia aqui é uma edição genética direcionada é uma inserção de DNA em locais específicos do Genoma Então essa essa tecnologia Cris PR é caso 9 é uma metodologia ainda um pouco recente uma técnica um pouco recente que está sendo utilizada vocês podem estar pesquisando também nos materiais na biblioteca no ambiente online nos livros sobre essa tecnologia também nos artigos científicos como nós observamos né o genoma humano é algo que veio aí sequenciado aproximadamente ela em 2001 depois disso novas técnicas vem sendo aprimoradas nessa
tentativa também da cura de doença na busca da terapia gênica Então essa nova tecnologia do Chris casonove ela vem para que possa manipular os genes lá no DNA de interesse lá no Genoma Humano por exemplo o que que isso iria ajudar é ter lá um fragmento de interesse poder inserir o manipular dentro daquele você substituir aquele gene de interesse que ele poderia causar uma doença por exemplo em relação ao câncer que aquela célula que vai se desenvolvendo e multiplicando de forma anormal então nessa tecnologia eles vão estar substituindo aquele Gene para que essa doença não
se propague ou isso vai auxiliar também no tratamento de doenças genéticas raras que vai poder melhorar o tratamento e as pessoas terem uma condição de vida melhor em relação a esse tratamento porém ainda é uma técnica nova o que exige ainda muito da parte da bioética da da biossegurança que nós vamos comentar também dentro da biotecnologia é muito importante a parte dos aspectos éticos envolvendo tantos humanos quanto animais e também em relação a bioética que utiliza essa inserção do gênes quando tem toda essa modificação genética então aqui nós observamos nessa imagem a bactéria que foi
transformada por meio da inserção do fragmento exógeno do DNA e aqui a tecnologia chrispr caso 9 ó como novos observamos aqui tá vendo as tesourinhas aqui ó ocorrendo a endonuclease ali a enzima que vai quebrar aquele local do gênero lá de interesse aqui as junções de pontas não homólogas e dirigido por homologia que a gente observa aí vai ocorrer um reparo no DNA aqui tem o DNA doador e aqui o DNA novo então é como se fosse também uma modificação naquele local de interesse Onde você quer melhorar aquela característica naquela característica que vai proporcionar em
relação a uma doença uma característica que a pessoa apresenta e as aplicações da introdução do DNA em células vivas Então vai poder ser usada né já é usada para terapia genética no tratamento de doenças genéticas produção de proteínas recombinantes medicamentos e a parte Industrial modelos de estudo compreensão de funções genéticas Então primeiramente são feitos esses modelos de estudo para entender toda essa questão genética nas doenças nos tratamentos para depois então ser aplicado em vitro e envio nos organismos humano ou animal aqui está o nossas referências então Nesta aula nós podemos estar observando ali principalmente como
haja um vetor de clonagem os principais vetores que são utilizados que vocês podem estar aprofundando seus estudos nas atividades realizadas em todas essas atividades que vão sendo proporcionada ao longo da disciplina para apro fundar ainda os conhecimentos nessa parte da tecnologia do DNA recombinante então obrigada pela companhia aguardo vocês em nossa próxima aula um abraço [Música]
