no vídeo de hoje nós vamos falar a respeito dos fundamentos de espectrofotometria que seria o quê uma técnica de medição utilizando o espectro da luz e nesse caso né a maior parte dos espectrofotômetros eles têm uma luz branca uma luz branca então que vai emitir essa faixa de comprimento de onda do visível né a luz ela é do campo eletromagnético que ele vai se dissipar como ondas então nós temos aqui comprimentos de ondas que vão de 400 até os 750 nôm que são os comprimentos de onda da do que a gente chama do visível que
vai do Violeta até o vermelho então a luz branca seria a mistura de todos esses comprimentos de onda que quando são desmembrados são desmembrados nos nas cores que a gente fala que são as cores dos do arco-íris certo e é utilizando essa propriedade da luz que Esses aparelhos eles vão funcionar nós temos ainda comprimento de onda abaixo do de 400 que seria o ultravioleta então o comprimento de onda do ultravioleta ele vai de 100 a 400 então é abaixo de 400 né então é abaixo do visível temos ainda é os raios X que tem um
comprimento de onda menor ainda ainda tem aí os raios gama né radiação ionizante ela vai ficando com comprimento de ondas cada vez menores enquanto que comprimento de onda acima do 800 né do 750 e acima disso a gente tem o infravermelho e eh ainda maior né já na faixa de 50 a 300 eh micron ou micrômetro nós temos as micro-ondas e depois também temos as ondas de comunicação né de rádi com comunicação e telecomunicação que tem comprimento de onda cada vez maiores e se valendo do fato da luz branca ser desmembrada nos diferentes comprimentos de
onda é que os aparelhos possuem Então essa lâmpada que vai est emiti a luz branca certo que Como tá espalhada a necessidade dela ser condensada pelo colimador que funciona como uma lente né que vai direcionar essa luz agora num feixe em cima do Prisma e o prisma de quartzo Então vai desmembrar a luz branca nos diferentes comprimentos de onda e através de um seletor Eh que que vai subir e descer né ele vai selecionar exatamente qual comprimento de onda que vai passar passar e esse comprimento de onda que passa já a gente já fala que
é luz monocromática porque essa luz é de um determinado comprimento de onda selecionado né nesse seletor do aparelho e é essa luz desse único comprimento de onda aí que vai incidir sobre a nossa amostra que estará presente num tubinho que a gente chama de cubeta eh de volumes diferentes tem cubeta de 1 ml cubetas até de volumes menores e que aqui a luz então vai incidir sobre a sua amostra E caso exista nessa solução uma molécula que capte essa luz a luz é absorvida por essa molécula o restante da luz passa é transmitida e vai
incidir numa fotocélula e assim o aparelho através de um medidor galvanômetro vai verificar a quantidade de luz que está chegando nessa fotocélula como o aparelho sabe a quantidade de luz que foi emitida então Ele sabe a quantidade de luz que ficou absorvida e assim o aparelho vai nos dar a medida da absorbância certo e assim nós podemos investigar quanto dessa substância né existe dentro dessa cubeta Porque quanto maior for a quantidade dessa substância na amostra maior a sua absorbância mas para que nós saibamos qual comprimento de onda a substância em questão absorve mais a necessidade
de varrer o espectro da Luz em cima dessa substância que foi exatamente o que a gente fez na primeira parte da nossa aula prática Então como é que nós fizemos nós pegamos a nossa amostra né como tá aqui no roteiro Nossa amostra no caso era uma solução de azul de bromofenol que tava numa concentração de 0,01 MG por ml inclusive para facilitar as contas não ficarmos com números decimais nós podemos dizer que é 1 x 10 a-2 mg por ml certo Então essa é a nossa solução do corante que foi usado o metilorange seria para
fazer uma aula maior Então nós não fizemos isso e precisamos também do espect fotômetro Então a primeira coisa que nós fizemos foi varrer o espectro ou seja fazer uma curva de e espectro de uma curva de absorção espectral desculpem no dia da aula eu esqueci o nome Eu tô esquecendo agora de novo aí curva de absorção espectral então a gente fez essa varredura do espectro fizemos a leitura em todos esses comprimentos de onda daqui certo sendo que não fizemos diluído só fizemos ele na concentração que estava disponível que era essa aí 0 01 MG por
ml então nós fizemos essa curva de absorção espectral de maneira que nós obtivemos um pico de absorção espectral em 580 nanômetros nanômetros portanto todas as vezes em que eu for determinar a concentração de azul de bromofenol eu vou usar esse comprimento de onda para investigar a presença do azul de bromofenol na solução porque afinal de contas Esse é o comprimento de onda que mais absorve né outras moléculas mais absorvem em outros comprimentos de onda e assim nós podemos tirar aí o diferencial né e e darmos a concentração no caso aqui duas de bromofenol e desconhecido
eh todas as vezes em que nós fizemos as leituras antes de efetuar a leitura né quando nós trocamos o comprimento de onda no seletor há necessidade de uma nova calibragem do aparelho então o aparelho ele é Zerado com o branco que no nosso caso o nosso Branco foi água né então por que água porque água foi foi a solução que nós utilizamos para preparar o azul de bromofenol e o branco ele é um usado para descontar toda aquela leitura proveniente de coisas de substâncias que estão na nossa amostra mas que a gente não quer dosar
então como nós preparamos o azul de bromofenol na água então a gente utilizou a água como branco né então a a calibragem ela aconteceu em cada um dos comprimentos de onda primeiro calibra ava com o branco e depois efetuava a leitura e assim foi até terminar e a gente viu que ocorreu um pico aqui em 580 que depois até dá uma caída meio abrupta enfim o pico de leitura é 580 nôm Então nós vamos usar esse 580 nôm para fazer o qu agora a curva padrão a curva padrão ela trata-se do quê ela trata--se de
uma curva por que que ela é uma curva Aparentemente a gente vê sempre uma reta Mas por que que a gente vê uma reta porque a curva padrão ela nós geralmente estamos trabalhando com ela quando ela ainda é uma reta quando existe uma proporção entre a absorbância e a concentração e essa proporção é linear então nós podemos fazer extrapolações e assim determinar a concentração de amostras não conhecidas ao fazer a leitura e obtermos a absorbância quando nós estamos lidando com amostras muito concentradas né Essa linearidade se perde portanto eh passa a ser inviável nós trabalharmos
com esse tipo de leitura né que está fora da curva padrão por quê Porque não é não segue uma relação linear Então essa esses valores de concentração vão estar fora da realidade porque não tem como fazer a extrapolação a não ser que você faça uma regressão não linear então para manter e a fidedignidade essa relação nós utilizamos apenas amostras diluídas a gente não pode usar amostra muito concentrada quando amostra que nós estamos dosando né desconhecida ela dá um valor de absorbância fora da nossa curva padrão nós não podemos usar essa medição é necessário que o
tubo seja diluído para que a gente possa encontrar um valor de absorbância que caia dentro aqui da nossa da nossa parte reta da curva padrão Ok então Eh agora na segunda parte da nossa aulinha o que foi feito foi feito a parte da curva padrão que parte é essa foi pipetado esses volumes do nosso corante que tava naquela concentração né que é e aqui vezes 10 a-2 mg por ml Então essa aqui é a concentração inicial do nosso azul de bromofenol em todos os tubos foi usada a mesma concentração Inicial mas foram pipetados volumes iniciais
diferentes depois adicionou água para um volume final de C em todos os tubos então todos os tubos tiveram esse volume final 5 ml E aí eu vou querer saber qual é a concentração em cada um desses tubos e isso é fácil né Vocês podem usar aquela forminha que concentração Inicial vezes o volume Inicial é igual a concentração final vezes o volume final então nós temos temos aqui que para o tubo um nós usamos uma concentração eh inicial de um né vezes 10 a-2 mg por ml Na verdade essa concentração Inicial foi usada igual em todos
os tubos então aqui é um vezes o volume Inicial que no tubo um foi um é igual a concentração final que é o que eu quero saber vezes o volume final do tubo que foi cinco né aqui 4 mais 1 5 então nós temos aqui que a concentração final é igual a 1 divididos por 5 então a concentração final vai ser igual a 0,2 para esse tubo um aqui né vees 10 a- 2 MG por ml Ok e se vocês fizerem pros outros tubos vocês vão ver que vai dar 0 V 0,6 0,8 e 1
ok continuando Então pessoal e Aqui nós temos os valores da concentração conforme nós calculamos e eu vou colocar aqui uns valores de absorbância e hipotéticos Ok então como se essa absorbância fosse obtida realmente lá no espect fotômetro né Para que vocês possam acompanhar e possam reproduzir com os dados de vocês então o tubo branco não vai ter leitura nenhuma porque é com ele que nós vamos calibrar o aparelho né zerar o aparelho em 580 nanômetros e depois vamos fazer todas essas leituras a primeira leitura deu aqui 0,030 a segunda 0,065 aí depois 0,098 0,130 e
0,175 obviamente que vão ser valores diferentes dos valores de vocês porque esses valores aqui são hipotéticos né então uma das formas de calcular agora é a gente plotar esse isso aqui pode ser feito no papel milimetrado E aí a gente vai com os valores descobrir o valor do desconhecido né que nós fizemos uma leitura do desconhecido e o desconhecido que a gente não conhece quanto tem de água nem de azul de bromofenol ou seja não sabemos a concentração mas a absorbância do desconhecido deu z0 072 pois bem é o que a gente quer saber a
gente quer saber qual a concentração dessa amostra desconhecida nós sabemos a concentração do padrão agora é só fazer uma relação Então a primeira maneira e a maneira mais simples é através da extrapolação gráfica utilizando um papel milimetrado para fazer o nosso gráfico então eu baixei esse papel milimetrado na internet e eu montei o gráfico Então nesse papel milimetrado que eu baixei na internet como eu vou eh escolher aqui né a a minha o meu a minha posição só que assim esse negócio Vixe virou aqui pera aí esse negócio aqui para fazer é difícil viu essa
esse tá não tem essa precisão aí eu vou colocar aqui olha o o eixo do X correto e o do Y né é o meu gráfico vai ocupar esse espaço aqui que eu quero que ele ocupe beleza né Aí eu tenho é esses valores de x que então x vai até 1 o meu máximo é um aqui né então eu posso botar aqui ó 0,2 0,4 0,6 0,8 e um né não vai até lá deixa eu apagar esse esse restinho aqui apagar tudo já saber tudo bem Maria Ok então isso aqui é o quê é
a concentração de azul de bromofenol no caso fizemos vezes 10 a- 2 MG por ml e no eixo Y é a nossa absorbância né que foi a leitura então Ah nós nós tamos o ponto zero lá né em 02 de concentração a leitura foi 030 0,030 o máximo aqui é 0,175 então eu posso colocar aqui no meu máximo é 0,2 né eu posso fazer assim pera aí 0 V é 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 vamos subir um pouquinho só aqui tem que apagar a linha toda PR subir pronto então 1
2 1 2 3 4 5 e aqui seria o o 0,1 1 2 3 4 5 aqui seria o 0,2 Ok então é o zero é 0 o 0,2 de concentração né que é aqui 0,2 0,4 0,6 0,8 e 1 então 02 de concentração é uma leitura de 0,030 então 0030 nós estamos de dois em dois aqui cada cada 10 né então aqui vai ser e e nós vamos ter que aqui olha que é na metade é o 0,05 então cada cinco quadradinhos desse aqui tá representando 0,01 então o 0,0 30 vai ser aqui assim
ol aqui assim e aí é o ponto é esse aqui ó 0,03 né 030 de leitura com 0,2 de concentração Esse é o ponto um o ponto dois já vai ser 04 de concentração com uma leitura de 0,0 65 né então então aqui é o 05 0,06 é aqui 65 é no meio aqui ó é aqui na concentração de 0,6 x 10 a-2 mg por ml nós temos a leitura de 0,098 Então vai ser aproximadamente aqui no né 98 o próximo ponto que é o 08 é em 0,130 então mesma coisa aqui ó aqui é
0,015 né o desculpa é 0,15 então o 08 é em 0,130 então 08 aqui é o 01 011 012 e o 013 vai ser aqui e o próximo que é um é o 0,175 então 1 vai ser 175 0 vula aqui é 150 160 175 vai ser aqui assim no meio ó meio ISO aqui pronto aí agora a gente pode traçar a melhor reta desses pontos né a gente vê que tá muito bonitinha aqui olha a nossa a nossa reta ok a gente traça aí a melhor reta Ok E aí a gente vai fazer o
a extrapolação gráfica pegar a leitura do desconhecido e jogar aqui no nosso gráf a leitura do desconhecido deu 0,072 então através da extrapolação gráfica nós podemos determinar como o 0,072 ó 05 06 07 aqui o 0,072 ele é aqui assim ó E aí a gente vai até a reta e desce aqui é 04 aqui é 05 seria 0,44 né aqui no meu olho aqui seria 0 V 44 x 10 a- 2 MG por ml Essa é a concentração do desconhecido que nós obtivemos através da extrapolação gráfica plotando o gráfico num papel milimetrado né é a
forma mais simples da gente determinar Qual é a concentração da amostra desconhecida a segunda maneira de determinarmos qual a concentração dessa amostra desconhecida é através do cálculo do fator de calibração o fator de calibração ele vale a concentração da sua amostra que no caso aqui é o azul de bromofenol divididos pelo valor da absorban obtida no no tubo né no caso no espectrofotômetro do tubo no espect fotômetro então isso aqui é o fator de calibração tá e o cálculo é bem simples é só mesmo a gente no caso a concentração 0,2 divididos por 0,030 isso
vai dar 6,66 o próximo 0,4 di por 0,65 vai dar 6,15 e se vocês forem fazendo né vai ver que esses valores eles são bem perto Isso significa que essa curva tá muito boa tá bem retinha né Foi bem ops não nada a ver é isso mesmo 5,7 eu tava aqui elogiando mas ainda tá dentro né 5,7 é um valor bem próximo na verdade todos esses pontos estão bem dentro e nós vamos usar todos eles agora para calcular o fator de calibração médio que é a soma de todos eles divididos por cinco né porque são
cinco entradas então o fator de calibração médio nesse caso aqui foi de e 6,16 é o nosso fator de calibração média agora olha que coisa se nós pegarmos o fator de calibração médio e multiplicar pela absorbância do des nós vamos ter a concentração desse desconhecido E se nós fizermos essa conta vai dar aqui olha 0,443 o qu x 10 a- 2 MG por ml bem idêntico praticamente acho que idêntico né foi 0,44 que a gente achou lá através da extrapolação gráfica então nós vemos aqui né bem semelhante Opa voltei nós vemos aqui olha bem semelhante
a a concentração certo e a última é através da equação da reta só que pra gente obter a equação da reta a partir desses pontos a gente vai precisar ou fazer a as contas o que ninguém mais faz ou então vamos fazer no no Excel uma equação da reta bom pessoal então eu abri aqui o Excel e eu vou agora fazer o gráfico no Excel para poder ele mear a equação da reta que a gente precisa para isso eu coloquei os dados da concentração e da absorbância eu vou selecionar todos os dados e vou pedir
para inserir um gráfico no caso um grfico de dispersão um grfico assim pronto já tá aí o meu grfico agora o que eu preciso preciso da regressão desses pontos da regressão linear que o Excel faz pra gente então como é que eu vou fazer isso bem se você tiver no computador você clica com o botão esquerdo nos pontos e depois clica com o botão direito e vai aparecer a opção de adicionar linha de tendência eu aqui vou ter que vir em mais elementos que eu tô no tablet e vou botar lá ó linha de tendência
né então eu quero uma linha linear a minha linha de tendência eu vou pedir para adicionar também a ué a a fórmula que era para tá aqui no computador aparece nesse momento deixa eu achar isso então eu achei para poder a gente adicionar a equação a gente vem aqui né seleciona gráfico né vem aqui em gráfico depois vem em layout e aqui no layout a gente vai pedir esse layout aqui olha que tem a linha de tendência pronto essa é a nossa linha de tendência veio com tudo também veio até com o que quadrado né
o r quadrado na verdade porque é da reta Então uma reta bem boa lá deu quase um nosso R Quad e aqui a gente tem a equação da reta que é essa equação y é igual a 0,172 6x - 0,0033 Então essa equação é daquela equação da reta Y = Ax + B vamos para um quadro para poder eu explicar para vocês bem então eu trouxe para cá o nosso gráfico com a equação da reta n tá aqui e agora eu preciso saber qual é a concentração do desconhecido o valor da absorbância do desconhecido foi
0,072 então Eh nós temos que substituir esse valor lá na equação a equação é y = 0,12x Men 0,0033 a equação da reta Y iG Ax + B sendo que B é o valor de X Aonde a a reta bate no eixo do X então no caso aqui tá me dizendo que é um valor negativo significa que ela tá batendo aqui para baixo certo e o a é a angulação da reta Então nós temos que substituir o valor de absorbância no Y certo porque isso aqui é o y do meu desconhecido então 0,072 é =
a 0,17 26x - 0 V 0033 Então a gente vai passar esse valor para lá se ele aqui tá e subtraindo ele vai para lá somando certo e e a gente vai evidenciar o x depois então se aqui tá multiplicando vai para lá dividindo então x é igual a 0,072 mais 0,0033 tudo isso divididos por 0,17 26 e a gente vai ver que x igual 0 V 0753 divididos pelo 0,17 26 e isso vai dar 0 V 436 2 4 36 a gente pode aproximar para 0,44 também né mas fica aqui olha bem próximo do
que a gente tinha encontrado vezes 10 a-2 mg e por ml né então geralmente a gente aproxima mesmo para duas casas e a gente chegou à conclusão que os três métodos que nós utilizamos foram bastante eficientes em calcular a concentração do desconhecido
