Espectrofotometria UV-Vis - vídeo-aula e vídeo-tutorial

Olá pessoal Essa é a apresentação e sobre a prática que vocês vão fazer sobre espectrofotometria no V visível e apenas para vocês eh contextualizem esse essa aula Nós faremos aqui uma aula introdutória ao experimento que vocês vão fazer no no laboratório é com cone a agenda de vocês então meu objetivo aqui é fazer uma breve explicação sobre o objetivo sobre o o fundamento geral da da técnica as aplicações eh descrever especificamente o experimento que vocês vão fazer e explicar um pouco sobre o desenvolvimento da prática que vai ser feita lá no no laboratório e Inclusive

a seguir vocês terão um tutorial sobre o uso do do equipamento e tal qual vai ser feito lá no dia do do experimento de vocês tratando da espectrofotometria no ultravioleta e visível eh no caso dessa aula em particular nós estamos eh trabalhando com o fundamento da absorção da radiação eletromagnética pela matéria Tal Qual vocês já já viram nas aulas teóricas aqui nessa figura eu represento rapidamente para vocês lembrarem um diagrama de de energia então na figura eh da esquerda nós representamos as possibilidades de de transições que são comuns no infravermelho ou seja aquelas transições para

níveis vibracionais e e rotacionais e citados e no visível ou seja uma transição entre níveis eletr eh com menor diferença de energia e também no ultravioleta ou seja onde a diferença de energia na absorção do do do fóton de luz provocando a excitação do elétron ela se dá eh Em um nível mais alto eh na direita nós temos uma representação dos diagramas de dos níveis eh eletrônicos de orbitais moleculares que é o que explica um pouco as possibilidades de absorção que nós temos em moléculas na aula que vocês eh terão lá no laboratório eh o

objetivo Ele é bem simples e consiste na determinação da concentração de permanganato eh no meio acoso eh o permanganato ele existe por exemplo na indri indúsria farmacêutica na forma de comprimidos ele tem aplicações por exemplo para tratamento de alguns problemas de de pele e no processo de de controle de qualidade desse comprimido que é obtido a gente pode ter necessidade por exemplo então de fazer determinação do permanganato e o permanganato ele possui essa coloração Violeta como vocês vem aí no nessa figura do do balão volumétrico E isso se dá por causa de um fenômeno de

absorção que é chamado de transferência de de carga ou seja o elétron que faz parte da ligação entre o oxigênio e o manganês eh no na no no íon permanganato ele pode então absorver radiação eletromagnética na na região do visível e esse elétron então ele vai ser citado para um orbital do eh átomo do do manganês mas especificamente o orbital D do manganês Então esse transferência de uma ligação no caso ligação manganes do elétron de uma ligação manganes oxigênio paraas do manganes é chamado de transferência de carga e alta absorção doção viol e com base

nessa característica do permanganato absorver então a de ação eh nessa região do do espectro nós podemos então fazer uma aplicação por espectrofotometria para determinar então a concentração do permanganato e esse é o espectro típico do do permanganato E então um dos objetivos iniciais da nossa aula vai ser obter uma varredura espectral do de uma de permanganato no tutorial que nós mostraremos a seguir isso vai estar bem descrito então nós poderemos Identificar qual é o comprimento de onda máximo de absorção por volta de 526 nanom onde Nós faremos então a as determinações fotométricas então primeiro primeira

parte do experimento de vocês no laboratório vai ser obtenção desse espectro nós temos aqui um esquema bante simplificado que vocês já conhecem do diagrama de eh blocos de um espectro fotômetro então nós temos a fonte nós temos um seletor de comprimento de onda o recipiente pra amostra e o detector que vai então Eh transferir o sinal para o sistema de aquisição de dados que no caso do nosso experimento é um computador existem vários tipos de espectrofotômetros essa figura essa esse diagrama que eu coloco aí para vocês ele diferencia Então os espectrofotômetros com configuração de feix

simples e feixe duplo e esses detectores de feixe duplo eles podem ter esses eh espectrofotômetro de feixe duplo eles podem ter uma configuração com apenas um detector e com dois detectores particularmente nessa aula de vocês vocês terão o o a disponibilidade de operar um equipamento de feixe duplo com dois eh detectores a vantagem do equipamento de feixe duplo é justamente a maior estabilidade do da leitura de absorbância ao longo do do tempo nessa tabela nós temos a comparação então de um feixe simples que tem um preço menor ele é de construção mais simples porém ele

tem essa desvantagem de não ter uma longa estabilidade no tempo aqui essa figura mostra uma comparação de um equipamento de de feixe duplo eh onde nós temos a linha vermelha mostrando que a variação da intensidade da absorbância lida numa mesma condição ao longo do tempo ela varia bem menos do que essa linha azul onde nós temos Então o a leitura da absorbância mantendo-se a condição constante porém usando-se um equipamento de feixe Simples então a vantagem desse equipamento que nós vamos usar é que ao longo do tempo ele mantém a estabilidade eh permitindo então análises mais

eh precisas e principalmente mais exatas nós temos aí a figura da configuração do do equipamento que vocês vão operar no no laboratório mostrando então que eh a radiação emitida pela lâmpada ela vai eh passar pelo monocromador nós vamos ter então uma radiação monocromática eh passando por um divisor por um espelho divisor eh de de feixes então aí representado com a com a letra BS nós temos um espelho que é Semir reflexivo que faz a divisão do dos feixes de radiação então esses feixes divididos eles vão poder passar um deles pela referência e o outro pelo

compartimento onde nós teremos a os padrões e as amostras e cada um desses feixes vai chegar independentemente em um detector eh do tipo eh diodo de de silício muito bem eh em termos do roteiro da prática de vocês que vocês têm aí em mãos qual quais serão os procedimentos eh operacionais de vocês primeiro passo como eu já mencionei é obtenção do espectro e a determinação do comprimento de onda máximo de absorção a partir Então desse ponto vocês mudarão conforme o tutorial vai explicar para vocês o modo do equipamento de de modo espectral para modo fotométrico

ajustarão o comprimento de onda máximo definido eh na varredura que vocês fizerem então poderão fazer a leitura dos padrões e das amostras paraa finalidade de quantificação vocês terão cinco eh padrões diferentes cinco concentrações diferentes no roteiro de vocês pede para que vocês já deixem calculados os valores dos volumes que vocês tomarão da solução stock para facilitar o preparo da das soluções no dia da aula de vocês então existe uma tabelinha no roteiro de vocês para essa finalidade eh em seguida tendo-se Preparadas essas soluções vocês farão a leitura em triplicata ou seja três vezes o procedimento

de preparar a cobeta com a solução e levar até o equipamento para fazer a leitura Então essa leitura em triplicata de cada um desses cinco pontos dessas cinco concentrações diferentes paraa curva de calibração então vocês terão uma curva de 10 mg por L um ponto de 10 mg porl um de 20 30 40 e 50 cada um deles será lido então em triplicata após a leitura da triplicata do primeiro ponto da primeira concentração vocês vão fazer uma vão intercalar e com a leitura de um branco ou seja vocês lavarão a cubeta preencherão ela apenas com

água que é o branco dessa análise e registrarão também conforme a tabela que consta no no roteiro de vocês o valor da medida da absorbância da água é eventualmente Se houver uma leitura residual lá no espectro fotômetro vocês podem clicar em Auto Zero e aí vocês vão o equipamento para evitar qualquer forma de de variação feita a leitura então de todos os padrões e dos brancos para ser estimado o ruído ou seja oscilação aleatória do do sinal do equipamento ao longo do tempo vocês eh deverão analisar as amostras A e B também em triplicata esses

valores de absorbância também serão registrados no no roteiro de vocês para que posteriormente a do tratamento dos dados vocês possam então Eh fazer a calibração e a determinação das concentrações dessas amostras desconhecidas para finalizar o o tratamento dos dados eh após o a execução da prática então nós pedimos no no relatório no no no no tratamento então dos parâmetros analíticos desse desse método que vocês determinem a linearidade do do da análise aval o coeficiente de correlação da curva que vocês fizeram aval de detectabilidade do método a partir dos brancos façam a estimativa do ruído e

a partir Então desse ruído possam estimar o limite de detecção e o limite de quantificação que esse método apresentou eh a seguir eu vou fazer apresentação e da aula de fia e os resultados que vocês terão com a aula de espectrofotometria eh serão comparados deverão ser comparados por vocês aos resultados da aula de fia eh uma vez que as amostras analisadas serão as mesmas inclusive os padrões que vocês prepararam para a espectrofotometria também serão os mesmos padrões usados para o experimento de fia bem era isso então a seguir vocês vão eh eh ter o acesso

rapidamente é um tutorial que explica a operação do equipamento boa aula para vocês agora pessoal eu vou demonstrar para vocês como vão ser os procedimentos para operar o espectro fotômetro aqui no no laboratório de de ensino eh essa aula ela nós vamos fazer a determinação do permanganato em em Água usando Eh um espectrofotômetro de de de feixe duplo com dois eh detectores Então nós vamos fazer alguns procedimentos de de varredura espectral e de determinação fotométrica com a finalidade de de determinar a concentração de Hi permanganato em duas amostras conforme o roteiro que vocês eh tem

disponível para seguir vocês terão preparado na parte Inicial dessa aula se concentrações diferentes do permanganato e vocês terão duas amostras desconhecidas PR determinar ao final a concentração Lembrando que essas mesmas soluções elas também serão usadas por vocês na aula de injeção em fluxo aula de fia que será feita no no mesmo dia então primeiro item que eu quero mostrar para vocês é o a operação das cubetas que são usadas para as leituras dos padrões e das amostras no espectro fotômetro essas cubetas elas devem estar limpas quando nós usamos solventes aquosos basicamente nós precisamos fazer limpeza

com água se H algum resíduo de materi orgânico aderido na superfície nós podemos eventualmente fazer a limpeza com etanol ou eventualmente existem soluções apropriadas para uma limpeza mais forte lembrando o detalhe de não que nós não devemos usar soluções alcalinas com esse tipo de de cubeta porque e ela essas soluções alcalinas acabam atacando a superfície do do vidro então uma vez que nós temos E essas cubetas limpas o primeiro procedimento Que Nós faremos com o equipamento e de feixe duplo será o ajuste da linha de base usando a água como Branco nas duas linhas na

linha de referência e na linha de leitura dos padrões e da amostra Então eu estou aqui preenchendo as cubetas nós devemos mantê-las com a superfície externa seca e garantir que não existam bolhas no interior da cubeta geralmente nós preenchemos aproximadamente 23 da cubeta para Que ela possa então alcanar o feixe de radiação do do equipamento então fiz o posicionamento de uma cobeta vou rapidamente aqui fazer o mesmo procedimento de limpeza dessa segunda cobeta outro detalhe importante além de garantir que a cubeta esteja com a superfície limpa é segurar apropriadamente o a a a cubeta onde

nós temos a superfície fosca do vidro então vocês vão perceber que são duas superfícies foscas e duas superfícies transparentes e nós só devemos segurar na nas superfícies foscas e o último detalhe com relação a posicionamento da cubeta no espectro fotômetro é que nós devemos atentar para posicioná-las sempre com a superfície transparente no caminho de passagem do feixe de de radiação então Nós aproveitamos a marcação a letra eh que indica a marcação do tipo de cubeta que nós estamos trabalhando definimos o lado que nós vamos deixar essa essa letra eh virada Geralmente eu deixo essa letra

voltada para mim então eu vou saber exatamente a posição que eu vou deixar as cubetas dentro do equipamento muito bem a operação de um espectrofotômetro ela é bastante simples basicamente nós vamos usar o modo de operação espectral para fazer a aquisição do espectro e definir qual o comprimento de onda ótimo para as leituras dos padrões e das amostras então eu vou mostrar para vocês aqui nós temos uma modo fotométrico que será utilizado a seguir e o modo espectral o modo de espectro onde nós vamos fazer a leitura varredura da amostra primeiro parâmetro que nós temos

que definir aqui no método é o intervalo de de varredura e para uma varredura Inicial nós vamos definir o início Em 800 nom e o final da varredura em 300 NM para uma aquisição Mais Rápida desse espectro nós vamos usar a velocidade rápida aqui fast e podemos usar o intervalo de incremento da Leitura maior de 2 nanom então definimos aqui essas condições iniciais do do método e aí o primeiro procedimento é fazer o ajuste da linha de base eu vou registrar aqui a linha de base a a linha de base do a a aquisição do

espectro eh sem o ajuste da linha de base para vocês verificarem que após o ajuste da linha de base nós teremos um detalhamento melhor aqui do um refinamento melhor dessa dessa análise então aqui com a linha verde nós temos uma leitura uma varredura inicial do espectro sem qualquer ajuste do do equipamento e agora então eu vou promover com água na linha de referência e com água na na na linha de leitura vou clicar aqui em baseline para fazer um ajuste da linha de base de 800 a 300 nanom o equipamento Ele demora um certo tempo

porque vai ocorrer toda uma varredura do espectro então o monocromador desse espectro fotômetro ele vai estar se deslocando eh lá no interior do do equipamento para que esse ajuste seja feito isso vai demorar alguns eh segundos agora então que foi feito o ajuste da linha de base nós podemos registrar novamente a linha de base só para vocês verificarem que nós que é importante fazer essa correção sempre que nós começarmos a operar o equipamento então vocês vêm aqui com a linha verde que a linha de base ela não estava no no zero do equipamento e agora

que nós fizemos e essa correção da linha de base eu fiz uma nova leitura do branco e ele ficou oscilando com o ruído bem próximo ao zero muito bem e esse procedimento Inicial é só para vocês verificarem então a importância da leitura do branco da do ajuste da linha de base com o O branco eu fiz a a limpeza aqui do do espectro no software nós não vamos usar esse eh resultado e agora vou fazer simplesmente um ajuste da da escala do equipamento para que nós possamos fazer então o registro do espectro que nos é

de interesse que é o espectro da do padrão de Hi permanganato A partir dessa leitura do espectro do padrão de Hi permanganato é que nós determinaremos qual o comprimento de onda máximo de absorção para então trabalhar nesse modo na análise quantitativa que vai ser feita a seguir Então nesse momento eu vou retirar apenas a cubeta que fica na frente do do do espectro fotômetro Ou seja a cubeta onde nós fazemos leitura dos padrões e das amostras e a cubeta de referência com água ela permanece por todo o tempo no espectro fotômetro Então nesse momento eu

vou tomada a primeira solução de padrão preparada vou transferir um pouco dessa solução para um Beer Limpo nós devemos ambientar a cubeta com esse padrão Ou com amostra para evitar diluição e erro na medida da da concentração então eu vou fazer esse procedimento aqui duas vezes espalhando a solução pela parede da da cubeta então uma vez que eu garantir que a cubeta foi adequadamente ambientada com a solução do do padrão então eu posso agora fazer o enchimento da cubeta com a solução que vai ser lida muito bem apenas para garantir aqui que a cobeta ela

está limpa faça a verificação não tem a presença de bolhas não tem a presença de sujeira na superfície do do vidro e posso vir aqui clicar no botão start E aí nós teremos então a leitura do espectro de absorção eu posso fazer um duplo clique aqui e verificar que na região do do visível nós temos aqui Algumas bandas importantes de absorção ficando aqui nesse ponto do do software nós conseguimos verificar Quais são os comprimentos de onda máximos e mínimos com essas leituras então e aqui em dois nós conseguimos ver que nós temos uma leitura máxima

de 5260 nanom aqui em um nós temos uma leitura dura em 546 nom que são os dois picos de absorção na região do eh visível para refinar um pouco o comprimento de onda máximo nós podemos voltar aqui no método estreitar essa região espectral nós podemos fazer essa leitura então num intervalo de aproximadamente eh 200 mais ou menos 100 nanm uma janela de 200 nanm ao redor desse valor então tomando um um valor médio de 550 nós podemos fazer uma leitura de 450 desculpe de de de 650 até 450 nanm só que agora nós podemos fazer

uma leitura mais lenta e com um detalhamento espectral maior vou fazer opção aqui pela leitura de 0,5 com incremento de 0,5 em 0,5 nanom peço aqui então para registrar novamente esse espectro nós vemos que há uma sobreposição com o espectro Inicial porém nós vamos verificar que há um maior detalhamento apesar de uma análise mais lenta há um maior detalhamento dessa desse espectro que vai ser eh obtido vamos aguardar a finalização então da aquisição do espectro para definir qual o comprimento de onda máximo que nós vamos trabalhar para a leitura de todos os padrões e a

leitura de todas as amostras então aqui nós já conseguimos detalhar um pouco mais do do espectro estou dando um zoom apenas na Banda numerada aqui com dois e nós conseguimos ver que com essa análise mais lenta que com incrementos menores de leitura nós temos um melhor detalhamento do do espectro Acabou então de ser finalizada a leitura e a gente consegue ver aqui que no caso da segunda da segunda amostra nós temos aqui aqui no n marcado marcado com o número TR um comprimento de onda máximo de 525,5 nanm então usando Eh esse maior detalhamento nós

podemos definir em 525,5 o comprimento de onda ideal para fazer a a leitura dos padrões e das amostras no modo fotométrico ou seja essa banda aqui com maior intensidade de absorção na região do visível Então a partir de agora nós vamos mudar o modo de operação do equipamento para o modo fotométrico nós clicamos nesse ícone e teremos uma janela do software bem mais simples de operação basicamente nós temos que definir nesse ponto aqui como 525,5 o comprimento de onda de leitura e nesse outro ponto da janela nós poderemos fazer a leitura da absorbância medida pelo

equipamento eventualmente esse equipamento permite esse software permite que nós montemos toda a curva de calibração com todas as concentrações eh no momento da aquisição desses dados porém como posteriormente vocês não terão o software para tratamento desses dados Eu recomendo que vocês façam a anotação da leitura de absorbância para cada um dos padrões para que então vocês possam fazer o tratamento do dos dados de vocês ao término da aula nesse método nós temos então apenas que eh definir o o comprimento de onda e máximo para pra leitura e garantir que o equipamento continu com a leitura

do zero ante o o branco então eu vou voltar aqui rapidamente eu vou retornar a solução para o balão volumétrico vou fazer a limpeza da cubeta sempre que nós trocarmos de de solução nós devemos enxaguar a cubeta por duas ou três vezes para garantir que não há mais resíduos da da amostra ou do padrão anterior vou completar essa cobeta com com água novamente é importante sempre fechar a tampa do compartimento da dos padrões antes de se fazer a leitura e aqui nós podemos então perceber a leitura de absorção daquela solução de água que nós usamos

como branco é vocês veem aqui que há uma pequena leitura residual e para partir do do zero nas leituras das diferentes concentrações de de trabalho que nós temos nos padrões o que nós devemos fazer é clicar em autozero E aí automaticamente essa leitura ela vai ser zerada então em alguns segundos nós verificamos aqui que nós temos a leitura no zero e é importante diferenciar então que o ajuste baseline ou seja linha de base ele faz o zero de todos os intervalos de comprimentos de onda no processo de varredura espectral enquanto que o autozero ele faz

o ajuste do Zero Apenas no comprimento de onda selecionado aqui no modo fotométrico então uma vez que nós temos o equipamento com o branco estabelecido o procedimento agora que vocês terão que fazer é a leitura dos padrões do mais diluído até o mais concentrado e a leitura consecutiva das amostras de acordo com o o roteiro de análise vocês deverão fazer essas análises em replicatas né em três replicatas e entre cada uma dessas análises será feita a leitura do do branco então tal qual eu acabei de fazer o ajuste inicial da da leitura do Branco ao

término de cada uma das análises dos padrões padrão 1 padrão 2 3 4 e 5 entre cada uma dessas leituras vocês deverão fazer a limpeza da cubeta preenchê-la com água e fazer o registro do Branco essa leitura do Branco ela também deve ser anotada porque ela vai servir para depois fazer o cálculo do ruído do equipamento que será utilizado no na determinação do limite de detecção e limite de quantificação do método de vocês então simplesmente aqui o procedimento necessário é voltar a cubeta para a posição apropriada fechar o compartimento da amostra então nós temos aqui

a leitura da absorbância desse primeiro ponto 0,14 14 como valor de absorbância esse valor então deverá ser anotado para cada uma das leituras das replicatas e para a leitura do do branco bem o procedimento eh é é o mesmo para os padrões paraa leitura do branco e paraa leitura das amostras e ao fim então vocês terão preenchidas as tabelas do roteiro com esses resultados de absorbância e poderão tratar então esses resultados para a a confecção final do do do relatório eh pessoal de vocês para o o término da avaliação da essa disciplina