E aí o Olá alunos sejam bem-vindos a mais uma aula de imunologia clínica então a para fechar os nossos métodos de diagnóstico e imunologia Clínica eu trouxe duas técnicas diferentes hoje que é a imunofluorescência E aí Muniz tô química então elas vem auxiliando bastante no diagnóstico imunológico são duas técnicas diferentes que há uma usa fluorescência como enche a viu também e citometria de fluxo é e a outra imuno-histoquímica pode usar uma nuance mágica né para identificação de antígenos em tecidos então esses dois métodos né eles auxiliam muito no diagnóstico de antígenos tanto solúveis quanto esse
dois e no caso da técnica de imunofluorescência nós vamos utilizar flores floral cromos né Muito semelhantes àqueles a citometria de fluxo até alguns iguais para a gente identificar né algumas regiões o iguais é para a fim de Diagnóstico né molecular ou até mesmo dia de determinados anticorpos ou patologias autoimunes tá então no caso dessa doença a gente precisa das sementes para diagnóstico algumas doenças a gente precisa do que de um microscópio de imunofluorescência tá então esse microscópio de imunofluorescência específico ele tem filtros tá que vai auxiliar nesse processo de identificação e detecção de antígenos os
anticorpos marcados por exemplo com isso tiocianato de fluoresceína que é o fixe-o com rodamina neophytes na casa verde ou da mina caso pouquinho mais vermelhinho tem comprimento cioso diferentes um do outro eles vão emitir a energia em forma de luz quando absorvem radiação ultra-violeta então o microscópio emite uma radiação ultravioleta emitida nesse fluorocromo ele o filme tinha uma comprimento de onda em forma de luz e aí microscópio é por meio dele a gente consegue identificar né A Flor cromos distintos então no caso da imunofluorescência direta na imunofluorescência direta os antígenos vezes são detectados né com
anticorpo primário marcado então esse anticorpo primário ele já está marcado com fluorocromos tá ligado na porção FC com foram Cromo e ele é adicionado à mostra na lâmina tá então essa lâmina ela vai estar com uma com o tecido ou células presos ali Elas têm os antígenos específicos já nas suas superfícies tá é essa essa mostra então é que estava na lâmina é adicionada junto com anticorpos como fluorocromo esses anticorpos específicos a determinados antígenos não se ligar e a lâmina e após uma lavagem a gente vai identificar na emissão de radiação ultravioleta no microscópio a
emissão de luz tá caso ocorra a emissão de luz é porque esses antígenos estão presentes no tecido Isso é para identificação por exemplo de auto-antígenos de antígenos de alguns microrganismos também então a gente consegue identificar determinados microrganismos pela imunofluorescência direta tá se sentindo hein tá presente lá é porque o micro-organismos também está então a gente consegue identificar pela imunofluorescência direta se não houver é porque realmente não tem um antígeno presente então a gente consegue identificar vírus bactérias protozoários tá ele é um método semiquantitativo a gente consegue identificar link certa quantidade que a gente tem presente
nessa mostra e além da direta nós temos a imunofluorescência indireta na imunofluorescência indireta é uma técnica a gente vai utilizar né pra detecção de anticorpos ou antígenos no tecido tá ou em líquidos também a gente consegue analisar amostras como sangue também fluídos então isso certo identificar algumas doenças infecciosas e até mesmo doenças auto-imunes nessa identificação a gente vai ter o que a amostra contendo anticorpos por exemplo né vão se ligar a um tecido fixado na lama Então esse antígeno né específico de conhecido já pela gente né Tá fixado na lâmina a gente coloca Nossa mostra
por exemplo com o do soro é se a nossa mostra tiver um anticorpo específico contra o antígeno ela vai se ligar deve formar o complexo antígeno-anticorpo após uma lavagem Oi e a gente vai adicionar então um anticorpo contra imunoglobulina humana que a gente chama de anticorpo anti tireoglobulina tá esse é de corpo marcado aqui com fluorocromo ele vai se ligar na porção FC do anticorpo nosso se a gente tiver esse anticorpo contra amostra ou de corpo aí tá ligado na mostra e o anticorpo secundário ali marcado com o fluorocromo vai estar associado a esse é
de corpo humano foram Chrome não se liga a nenhuma região específica daqui somente anticorpos presentes no nosso soro tá então quando emitida a luz pelo microscópio a gente vai ter uma fluorescência e a gente vai identificar se nós tínhamos a anticorpo contra essa mostra tá aqui por exemplo a gente vai ver né A e nesta imagem a fluorescência com marcadores nucleares Então se vê a célula que toda marcada e o núcleo dela comprou pontilha Dinho por exemplo que é uma marcação intracelular que a gente tem a vantagem de utilizar algumas florescência porque a gente consegue
identificar e diferenciar anticorpos IgG MG tá ou até mesmo de enviar gente pegar isso a livro de mucosa é muito sensível com uma ótima e felicidade então a gente consegue identificar realmente quais tipos de anticorpos a gente tem ali e contra qual tipo de amostra Tá e é de fazer a padronização então a gente consegue fazer isso muito facilmente em qualquer tipo de laboratório o livro Clínica as desvantagens é o que necessita de um microscópio próprio para isso então a gente tem que adquirir microscópio de imunofluorescência a metodologia e manutenção são caras tá e depende
também da subjetividade da análise do do do biomédico do farmacêutico que está analisando a mostra então se ele conseguir às vezes identificar um padrão em uma célula um pouquinho diferente de outra é por isso que a gente tem que saber realmente né das amostras ela tem que ter padrões né controles bem importantes para de laboratório em laboratório para a gente realmente identificar aquilo é um verdadeiro ou é falso tá então a gente tem que saber muito bem né da subjetividade de quem vai analisar essas amostras porque às vezes pequenos pontilhados você a liberar um laudo
como reagente e às vezes não é que a gente pode se for Essência celular na própria célula então eles são é um quesito né aqui a gente análise em relação a imunofluorescência aqui é uma desvantagem na técnica um outro método que a gente tem de analisar antígenos teciduais é a imuno-histoquímica tá isso aqui que ela varia né daí só de ciências que não usa fluorocromo ela vai utilizar marcação por coloração e ela tem uma uma certa diferença em relação à obtenção da amostra por exemplo a nossa mostra ela pode ser utilizada a congelada ou paralisado
então a gente coloca e uma parafina e essa mostra então geralmente pode ser de biópsia ela é cortada né em tamanhos bem pequenos tá cerca de 4 micrômetros então poder porque a gente tem um microssomo né que é o criostato Então esse faz um resfriamento ali da moça ele corta em como se fossem pequenas fatias né de 4 micrômetros essa mostra vai ser fixada numa lâmina pré-tratada já tá esse tratamento é bem importante para fixação m Oi mostra para não alterar muito os antígenos da mostra tá porque a gente tem que fazer lavagens retirada dos
da parafina Então tem que utilizar formaldeído tá E tem que fixar né É por baterias então ele coloca ele tá no out long e Agreste lada e isso vai de bateria bateria a gente vai fixando ir mantendo a mostra mais íntegra possível tá então a gente tem que ter um cuidado muito grande na fixação é dessa mostra para não alterar os antígenos ali presentes se não a gente pode ter falsos negativos ou positivos tá é a mostra também tem que ter uma recuperação de gente pode colocar digestão por proteases né para recuperar o máximo possível
de amostras que estão mais internalizados até mesmo epitocos internalizados essa mostra ou a gente consegue fazer a temperatura de gerino gerini temático ou alterando-a assépticos mais superficiais expondo os mais internos na calcinha de ter uma recuperação antigênica alguns métodos não necessitam disso mas é uma desvantagem da imuno-histoquímica porque a gente pode perder né a esses é epitocos aquisição antígenos estão mais superficiais e que poderiam ser o que a gente estava procurando nessa Nossa mostra interesse aí depois de fazer todo esse processo de obtenção da amostra a gente vai conseguir fazer o que vai colocar o
anticorpo primário antígeno específico então fazer você é só pesquisando o antígeno tumoral então antígeno carcinogênico embrionário Então tem um anticorpo antígeno carcinogênico embrionário e coloque-se de corpo e ele se liga no que a na mostra se eu tiver é o incentivo na liga superfície ele vai se ligar com anticorpo eu faço uma lavagem e aí coloco um anticorpo secundário anti anticorpo tá então esse anticorpo secundário serve para aumentar a área de ligação e também tem vários anticorpos Alice ligados né então a gente vai formar como se fosse uma rede de ligação de anticorpos E aí
a gente faz mais uma lavagem E aí coloca um anticorpo marcado por uma enzima tá então é esse anticorpo pode ser a ligado a peroxidase a fosfatase alcalina tá ou até mesmo estreptavidina biotina que a gente tem complexos enzimáticos então a gente não vai ter somente uma enzima presa ali mas step tô medindo a biotina ele tem uma rede de enzimas presas esses anticorpos Então você aumenta a superfície de interação e assim você consegue verificar o A Essência os pontos marcados nessa lâmina nesse tecido Então você tem um monte de corpo primário um anticorpo o
anticorpo para aumentar a área e aí um de corpo né como se fosse terciário ali associado a essas enzimas peroxidase os fatais alcalina ou estepe avidina-biotina faz uma rede o polímero presa várias enzimas e aí sim quando você coloca substrato você vai obter uma grande área de marcação nesse tecido casa não tem um antigénio você não tem marcação alguma antes dele então esses métodos né eles vão servir para identificar no tecido tá tanto aí mundo histoquímica por meio enzimático-colorimétrico é até mesmo uma inflorescência existem atualmente alguns metros quanto a imunofluorescência né Que Vocês conseguem pegar
isso de amostras tanto a obtido por soro as amostras líquidas né quando teciduais de identificar regiões específicas com os fluorocromos então esses métodos de Diagnóstico mas atuais registei comemos histoquímica é marcação antígenos teciduais nela que é mesmo de patógenos que estão nos tecidos é tanto quanto a imunofluorescência a gente consegue fazer marcações tanto Extra celulares controles celulares e assim a gente consegue identificar diferentes tipos de patologias de que vão desde doenças auto-imunes tá são bem analisados em relação a isso aí eu falei se quanto a também alguns diferentes tipos de patógenos que é vem uma
cometer a determinados tipos de tecidos humanos tá então espero que você tenha entendido um pouquinho da nossa aula e a diferença em relação à imuno-histoquímica tá E aí mostrar esse amor florescência gente tem métodos né semelhante a ele também usa aparecesse como e também crediflux só que lembra citometria de fluxo são celas separadas de uma uma contabilizado já a imunofluorescência a gente pega o tecido como geral Então usa o mesmo fluorescence só que são tecidos diferentes células ou tecidos separados Mc química é a nível enzimático tecidual diferente o que a gente faz um Elisa que
somente a mostra que a gente vai utilizar ou até mesmo aquilo menos seis então espero que você tenha entendido pouquinho de quais tipos de amostras diferentes a gente pode utilizar analisar e quais técnicos a gente tem que escolher em relação ao que a gente vai utilizar tá então até o próximo módulo que a gente vai ter um pouquinho sobre os parâmetros e sobre as patologias associadas a imunologia Clínica igreja basta abraço e até mais é [Música]
