[Música] eu sou Israel felzen falb coordenador do laboratório de mutagênese Ambiental do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro ao longo de mais de 20 anos nosso laboratório vem analisando os efeitos del e biológicos de Agentes físicos químicos e biológicos para a saúde humana e ambiental nos últimos anos Andreia da Silva Fernandes e Carlos Fernando Araújo Lima este do laboratório Integrado de mutagênese ambiental da Unirio se juntaram ao labm na área de mutagênese e toxicologia ambiental estamos interessados em estudar os efeitos de fármacos produtos naturais alimentos e poluentes
ambientais sobretudo tudo em relação aos danos causados na estrutura e função do DNA e suas consequências as metodologias usadas por nosso grupo permitem entre outras a identificar e compreender os mecanismos relacionados à interação dos mais diversos materiais com o DNA em modelos padronizados para o desfecho de genotoxicidade e mutagenicidade recomendados pelas agências de harmonização como a oecd nosso laboratório integra a rede de laboratórios que participam da avaliação interlaboratorial para o teste de hes ou ensaio salmonela microssomais pela mutagen Brasil Esse é um ensaio primordial para averiguar a mutagenicidade de qualquer produto que tenha intenção de
consumo para a saúde humana ou animal além desses outros ensaios em vitos recomendados como modelos alternativos a uso em larga escala de experimentação animal como o ensaio de micronúcleo em vitro com bloqueio de citocinese em diversos modelos de células eucariontes e os ensaios de fototoxicidade em vitro com queratinócitos humanos realizamos também ensaios de antim mutagênese e químio proteção buscamos em nossos trabalhos garantir a segurança e eficácia no uso de novas moléculas desenvolvidas de modo a permitir que as mesmas possam ir para seus devidos fins terapêuticos como candidatos farmaceuticos e nanomateriais com aplicações médicas ao longo
desses anos temos formado recursos humanos qualificados para a área acadêmica e para o mercado de trabalho proposto em 1973 pelo cientista norte-americano Bruce Ames o teste de mutação reversa bacteriana também conhecido como salmonela microma é utilizado para avaliação de Agentes causadores de mutações gênicas pontuais ao investigar o metabolismo de istidina das bactérias e no intuito de substituir o uso de animais para determinar mutações ele foi capaz de isolar bactérias Mutantes para os genes do operon de istidina dessa maneira se tornou possível detectar mutações de ponto linhagens foram criadas através de modificações de uma parte da
sequência de DNA da bactéria salmonela entérica sorovar furrion fazendo com que as linhagens Mutantes sejam incapazes de produzir istidina Além disso as linhagens receberam outras modificações para aumentar Sua sensibilidade a mutágenos a mutação rfa promove a perda parcial da cadeia de lipar que reveste a superfície bacteriana tornando a mais permeável a grandes moléculas a mutação uvb remove parte do sistema de reparo do DNA por excisão de nucleotídeos essa mutação também tornou as linhagens dependentes de biotina a linhagem ta12 não possui esta mutação o plasmídeo pkm 101 introduzido nas linhagens ta98 ta 97 97 a ta100
e ta12 promove o aumento da mutagenicidade espontânea e induzida através do aumento do sistema de reparo suscetível ao erro e confere também a resistência ampicilina o plasmídeo pq1 introduzido nas linhagens ta12 permite o monitoramento de mutações no par de base at diferindo da bateria usual de linhagens que detectam mutações nos pares GC o seu marcador é a resistência Tetraciclina cada linhagem é capaz de detectar uma combinação diferente de mutações através da alteração de Sua sensibilidade e sistemas de reparo no DNA as linhagens ta 1537 e ta98 conseguem detectar alterações nos quadros de leitura a linhagem
1535 consegue detectar substituições nos pares de base e as linhagens ta 97 97 a ta100 e ta12 são capazes de detectar substituições no par de base e alterações no quadro de leitura durante o processo de replicação do DNA acontecem erros naturais que podem culinar em mutações estas mutações são conhecidas como mutações espontâneas as bactérias Mutantes do teste de são capazes de reverter espontaneamente o nocal produzido gerando colônias proficientes na produção de istidina então mesmo quando cultivadas em um meio com baixa concentração de istidina é possível observar um número de revert espontâneos quando expostos a uma
substância mutagênica as linhagens aumentam a taxa de reversão e quando o número de revert presentes espontâneas é até duas vezes menor do que o número de Vertentes induzidas podemos considerar que o composto estado é mutagênico a versão vigente do guia de testes da USD recomenda a seguinte combinação de linhagens ta 15535 ta 1537 ou ta 97 ou ta 97 a ta98 ta100 e ta 62 totalizando cinco linhagens diferentes que devem ser testadas na presença e na ausência de metabolização exógena a metabolização exógena ent produzido através da utilização do homogen at de fígado de rato um
composto rico em cips enzimas oxidantes responsáveis por tornar substâncias mais polares e hidrossolúveis esse passo torna o experimento mais próximo das condições fisiológicas dos experimentos em vivo o sistema de ativação metabólica contém a fração s9 reconstituída acrescenta dos cofatores que devem ser adicionados no dia do ensaio formando um conjunto que é chamado de s9 mix os cofatores utilizados podem ser preparados e estocados e o volume de mistura s9 preparada depende da quantidade de placas do ensaio a ser realizado o s9 mix pode ser utilizado a 4 ou 10% e deve ser preparado no dia do
ensaio conforme a ordem e instruções do protocolo a preparação do experimento envolve a produção das placas de aggar mínimo suplementadas com sais VB 50 vezes e glicose 10% aidini biotin serão suplementadas na solução de Agar no momento do experimento todas essas soluções bem como a solução tampão devem autoclavadas paraar a esterilidade do proco o meio mínimo suado vertido cuidadosamente placas de Petre daab degica evitando assim a contam e após este procedimento é necessário aguardar o tempo de solidificação do mesmo outra etapa importante na preparação para o teste é a obtenção das culturas bacterianas a partir
dos estoques ao final da tarde do dia anterior ao teste deve se transferir 100 microlit da cultura do microtubo de uso rotineiro imediatamente após o descongelamento para o caldo nutriente se o laboratório optou pelo uso de placas Master transferir uma pequena quantidade do crescimento da cultura da placa com auxílio de uma alça de inoculação para o caldo nutriente incubar por per noite de 15 a 18 horas a mais ou menos 37º so agitação de 150 a70 RPM a checagem das características genéticas das linhagens utilizadas é essencial e podem ser discriminadas a seguir para checar o
requerimento de istidina até cinco culturas podem ser semeadas na mesma placa é necessário semear cada cultura com alça de inoculação estérel em placa de H mínimo com biotina e em placa de hgar mínimo com biotine e istidina todas as linhagens devem crescer apenas no meio suplementado com istidina para a checagem de rfa podem ser semeados até três culturas na mesma placa de ágar nutriente com auxílio de uma pinça estéreo colocar no centro de cada semeadura um disco de papel de filtro com cerca de 5 mm de diâmetro e 1 mm de espessura embebido em solução
de cristal violeta 1 MG por ml todas as linhagens devem apresentar alo de inibição de crescimento de no mínimo 14 mm para a checagem do V vrb é possível semear até cinco culturas em faixas horizontais e uma placa de Agar nutriente a tampa da placa deve ser deslocada para a lateral até cobrir uma das metades da semeadura sendo a outra irradiada com luz ultravioleta 15 w de potência a distância de 33 cm por 15 segundos deve-se constatar o crescimento na metade não irradiada de ta 1535 ta 1537 ta 97 97 a ta98 e ta100 e
ambos os lados de ta12 a presença do plasmídeo pode ser verificada em até cinco linhagens e uma única placa de H nutriente onde após a semeadura das linhagens deve-se estriar com uma alça de inoculação uma fina camada do antibiótico apropriado para cada linhar sobre o pontilhado são utilizadas estrias de inibição com ampicilina para ta 97 ta 97 a ta98 ta100 e ta12 e Tetraciclina para ta12 a reversão espontânea deve ser avaliada e acompanhada a cada experimento levando em consideração a média de reverentes esperadas para cada linhagem e o histórico do laboratório como citado anteriormente o
experimento pode ocorrer na presença ou na ausência de metabolização exógena representada pela presença do composto s9 mix os controles positivos devem ser considerados para cada uma das condições levando em conta o efeito da oxidação sobre os compostos iniciamos o procedimento pipet 500 micr de tampão fosfato ou s9 Mix a seguir são adicionados 100 microl do solvente das amostras como forma de controle negativo em seguida 100 microl do controle positivo finalmente são adicionados 100 microlit de suspensão bacteriana em todos os tubos e eles são levados até o Shaker onde ficam incubados por 20 a 30 minutos
após a pré-incubação São adicionados aos tubos 2 ml de ágar de superfície aquecidos a 45º e despolimerizar com uma solução contendo traços deid e biotina após isso os tubos são homogeneizados e vertidos em placas de Petre contendo meio de cultivo mínimo uma vez que o áa de superfície tem endurecido as placas são então invertidas e incubadas em estufa bacteriológica por 48 a 72 horas a uma temperatura de aproximadamente 37º C após o período de incubação é possível contabilizar o número de colônias presentes nas placas de controle negativo controle positivo e também nas placas tratadas com
as possíveis amostras atenção para o modelo de diluição das amostras indicado pelo guia de testes da USD propondo diluições seriadas para promover uma concentração homogênea em cada uma das cinco concentrações testadas no Capítulo cinco teste de end do livro da Toxic genética Toxic genômica editado pela mutag Brasil esse ensaio foi descrito em detalhes nele você pode conferir todos os protocolos discutidos e executados Neste vídeo
