Olá me chamo Juliana da Silva trabalho com genética toxicológica e a minha área de atuação é muita Gênese dentro desta linha de pesquisa utilizo diferentes métodos de citogenética para avaliação de danos ao DNA dos métodos que o destaco aqui está o teste de micronúcleos este teste é um dos mais eficazes para avaliação de instabilidade genômica sendo utilizado tanto para monitoramento humano ambiental ou passional quanto para avaliação da Saúde existem protocolos bem estabelecidos e já publicados esses protocolos buscam um padrão de qualidade e a capacidade de reprodução em diferentes laboratórios de um mesmo método a partir
de agora vocês vão ver um vídeo elaborado pela muita gente Brasil com todas as etapas deste protocolo antes da coleta realizar bochecho com água para enxágue da boca para coleta e para cada indivíduo utilize duas escovas girar a escova aproximadamente 10 vezes em um lado da bochecha no outro lado da bochecha utilize uma nova escova é importante lembrar que uma leve pressão deve ser aplicada ao girar a escova para atingir as diferentes camadas celulares da mucosa oral lembrar que os tubos com a solução Salina ou fixador devidamente identificados devem estar preparados antes da coleta das
amostras colocar 8 ml da solução Salina nos tubos ou se o material for ficar armazenado sob Refrigeração em fixador Sacomã para permitir o fechamento do tubo cortar os cabos as escovas logo após a coleta ou após armazenamento para permitir que as células presas nas escovas sejam liberadas utilizaram Vortex por 30 segundos [Música] agora as escovas já podem ser descartadas e os tubos seguem para a centrifugação lembre que a centrífuga deve estar sempre equilibrada assim para cada tubo deve ser colocado outro tubo do lado oposto com o mesmo peso após a centrifugação devemos observar a separação
das células do sobrenadante o sobrenadante deve ser descartado assim este será removido cuidadosamente preservando o pallet para não gerar bolhas misturando sobre nadante pallet a pera deve estar apertada antes de introduzir a pipeta de pastel no tubo nesta fase aspiração a vácuo pode ser utilizada um pouco do sobrenadante deve permanecer para não atingir o pallet Completar com um tampão de mucosa até a marca de 5 ml os passos anteriores homogeneizar com Vortex por 30 segundos centrifugação por 10 minutos a 1500 RPM observando o pet remoção do sobrenadante mantendo Pet e completar até 5 ml com
tampão de mucosa deve ser repetido por mais duas vezes assim finalizamos o passo de lavagem das células removendo elementos indesejados Como as bactérias [Música] adicionar fixador cannoy até a marca de 2 ml e homogenizar pode ser no Vortex deixar no fixador e na geladeira por pelo menos 10 minutos para o preparo das lâminas deveríamos centrifugar os tubos por 10 minutos a 1.500 RPM lembrem de deixar em previamente as lâminas limpas e identificadas remova o sobrenadante até a marca de 1 ml com a própria micropipeta que será utilizada para fazer as lâminas homogenizar a solução colocar
150 micro litros por lâmina sendo duas lâminas por indivíduo por segurança pode ser interpretada espalhar o material na lâmina [Música] dispor as lâminas em bandeja e deixar secar em temperatura ambiente antes dos corantes algumas etapas devem ser realizadas sendo todas em Capela de exaustão tratar as lâminas em etanol 50% depois em etanol 20% por um minuto [Música] lavar as lâminas em Água Ultra cura por dois minutos tratar as lâminas em hcl 5 molar por 30 minutos este tempo pode ser ajustado para melhorar a coloração das lâminas descartar o hcl lavar com água corrente gentilmente por
3 minutos mergulhar as lâminas em reativo de chifre por uma hora no escuro após o tempo de chifre tratar as lâminas em Água corrente por 5 minutos observe a microscópio sem imersão se os núcleos estão curados se não volte as lâminas ao corante após o chifre lavar com águas lâminas [Música] como decorar com Fast Cream por 4 Segundos e após lavar com água destilada dispor as lâminas em bandeja com papel toalha e deixar secar em temperatura ambiente A análise é o microscópio é uma das etapas mais importantes onde diferentes tipos de danos ao DNA e
morte celular devem ser observados as células podem ser observadas em imersão ao microscópio óptico Com ou Sem fluorescência Análise segue duas etapas a primeira etapa onde se avaliam 1000 células para se determinar a frequência das células basais diferenciadas binucleadas células com cromatina condensadaolíticas a segunda etapa são analisadas 2 mil células diferenciadas observando-se a presença de micronúcleos e de brotos nucleares assim teremos os diferentes tipos celulares relacionados a danos ao DNA ou Morte celular avaliados finalizamos aqui então o vídeo sobre o teste de micronúcleos em mucosa oral e lembrando ainda a importância da gente seguir protocolos
O que torna comparável os nossos resultados [Música]
