Aula 1 - Métodos de estudo da célula - Parte 2

o olá o tema da nossa aula de hoje é métodos de estudo da célula é bom lembrar que esta vídeo aula foi produzida para fins exclusivamente didáticos seguindo as recomendações da portaria mec 544 2020 que trata da substituição das aulas presenciais por aulas em meios digitais e resolução do conselho de ensino pesquisa e extensão da ufmg nº 02 2020 que regulamenta o ensino remoto emergencial para os cursos de graduação da ufmg durante o período de pandemia convite 19 portanto é proibida a cópia e distribuição deste material e de outros disponibilizados aqui e aqui vamos ver

a parte 2 da aula sobre métodos de estudo da célula e nessa vídeo aula vamos falar sobre preparação e coloração de amostras para microscopia as etapas de preparação do material para microscopia eletrônica e óptica são parecidas e ela se baseia em primeiro na remoção do tecido do animal é o da espécie mas eu observada este tecido é segmentado e processado passa por um processo de fixação desidratação inclusão e parafina corte e montagem da lâmina são paulo e as diferenças na preparação do material estão na nos tipos de substâncias utilizados em cada etapa para microscópios de

luz pi óptico se compararmos os dois nós vamos ver quem durante a fixação é utilizado para formaldeído ou metanol para microscopia óptica e glutaraldeído para microscopia eletrônica já no processo na etapa de desidratação é utilizado etanol este lol para microscópios de luz e acetona para microscópios eletrônicos a inclusão também é diferente quando na microscopia óptica é utilizada para fina na microscopia eletrônica utiliza-se plástico bom e este bloco de plástico no me para microscopia eletrônica é cortado em um microssomo que possui navalhas de vidro ou diamante já para microscopia óptica são utilizados navalhas de aço e

esses cortes finíssimos são colocados em lâminas de vidro quando são para microscopia óptica e pequenas grades ou redes metálicas para microscopia eletrônica e aqui mostramos o processo de inclusão do material em parafina derretida a parafina é colocada em um molde e o tecido é embebido nesta parafina quando a parafina endurece ela forma um bloco que serve como base para corte no micro tom e aqui mostramos o equipamento micrótomo do tipo manual rotativo ele funciona fazendo cortes finíssimos no bloco de parafina e esses cortes vão sendo coletados e após a coleta dos cortes de parafina eles

são colocados em um banho maria 40 graus que faz com que esses tecidos inclusos na parafina se desprendam e após isso essa etapa eles são recolhidos em lâminas de vidro e aqui mostramos os tipos de corte que podemos fazer em um material biológico e os diversos planos pode ser um corte do tipo transversal oblíquo longitudinal dependendo do tipo de corte amostra a mesma mostra se apresentará de formas diferentes na lâmina como podemos ver aqui um corte transversal oblíquo e longitudinal do mesmo tecido e agora vamos dar uma olhada quais são os métodos mais comuns de

coloração utilizados em histologia e como vocês já devem saber histologia é o estudo da morfologia microscópica das células e tecidos o utilizamos métodos de coloração para visualizar e distinguir diferentes partes das células e tecidos já que estas e suas estruturas são normalmente transparentes ou sem cor os tipos de corantes utilizados para curar as células e seus componentes podem ser específicos para uma estrutura em particular grupamento químico moléculas e também podem ser inespecíficos que no caso a maior parte da célula vai cobrar no mesmo jeito e vamos ver aqui os tipos de corantes mais comumente usados

na coloração histológica de células e suas estruturas antes de olharmos alguns exemplos de colorações histológicos eu gostaria de fazer um breve resumo dos tipos de corantes que são utilizados e nós temos os corantes ácidos e os corantes básicos e também temos uma combinação desses dois tipos de corantes você deve estar se perguntando porque assim estruturas celulares como ácidos nucleicos dna ou rna ou proteínas possuem grupamentos carregados que são conhecidos como grupamentos carboxílicos ou grupamentos fosfato só pra citar nome de 2 os corantes usados em histologia são componentes orgânicos coloridos que também possuem uma carga corantes

ácidos carrega uma carga negativa e por isso se ligam a estruturas carregadas positivamente é para te dar uma ideia vamos dar uma olhada rápida nessa representação aqui vemos os corantes carregados a negativamente se ligando a proteínas do citoplasma das células que são carregadas positivamente isso faz com que essa essas proteínas apareçam com a cor que aqui no caso é cor-de-rosa e já corantes básicos carregam carga positiva e se ligam a estrutura celulares carregadas negativamente oi aqui vemos os corantes carregados positivamente se ligando a membrana que é carregada negativamente isso faz com que a estrutura se

core de azul como neste exemplo a e os corantes neutros e também podem ser usados mas esses não carregam carga nenhuma e eu não vou entrar em detalhes sobre os diferentes tipos de corantes básicos ácidos ou neutros aqui foi só para mostrar de forma básica como esses corantes se ligam uma estrutura celular em particular e agora vamos falar um pouco sobre os corantes mais comuns utilizados em histologia e são eles a hematoxilina-eosina conhecida como h e e o ácido periódico de schiff ou ps a impregnação pela prata o azul de toluidina e o tricô mico

de manson oi e o tetróxido de ósmio primeira coloração que vamos falar é sobre a hematoxilina-eosina e e nessa foto vemos uma micrografia mostrando um corte de músculo esquelético corado com hematoxilina-eosina e como vocês podem ver todo músculo aparece em rosa e esses pequenos pontinhos distribuídos ao longo do tecido são os núcleos da célula e essa coloração é chamada com frequência de apenas coloração do tipo h e por conter dois corações a hematoxilina-eosina e e ai ma toxina é um corante básico horas estruturas ácidas orando é estas de cor azul ou roxo como os núcleos

das células que podemos ver aqui e já eusina é um corante ácido que se liga estruturas básicas como membranas intracelulares como podemos ver aqui apontado pela seta até a próxima coloração que vamos falar é sobre o ácido periódico de schiff e esta coloração vai ser baseado em processo histoquímico ou seja é uma técnica histológica que tem por objetivo a identificação da natureza química de constituintes celulares tão consiste na coloração específica destes constituintes recorrendo basicamente as substâncias que ao reagir com componentes celulares vão dar origem a produtos com cor o produtos clorados e a coloração ácido

periódico mais reativo de schiff ou simplesmente coloração ps que vem do inglês priori s direct chefe é um método de coloração muito utilizado em histologia e patologia ele primariamente é usado para identificação de glicogênio mais serve também para evidenciar outros polissacarídeos como a minha do celulose todos os polissacarídeos que possuem glicose em sua constituição a criança coloração vai servir justamente para isso para identificar glicogênio amido ou celulose em determinados tecidos bom então como falei essa coloração ela tem esse nome ácido periódico de schiff o que possui dois reagentes o reagente de schiff e o ácido

periódico o reagente estiver preparado misturando uma substância chamada fucsina básica que possui uma cor bonina com ácido sulfuroso essa mistura vai formar o que a gente chama de reativo de schiff que é uma substância incolor bom e o outro reagente é o ácido periódico ele é utilizado e juntamente com reagente de schiff pois esse ácido ao entrar em contato com substâncias como a glicose que contém glicóis que são esses compostos orgânicos que contém dois grupos hidroxilas ele seletivamente oxida esses grupos hidroxilas formando aldeídos esse é o de ido vai depositar no tecido e com isso

bom nós teremos o que a gente chama de reversão da cor do reagente de schiff ao entrar em contato com aldeído liberado o reativo de schiff vai produzir uma substância que tem uma cor púrpura magenta ou bonina ou seja falamos que essa substância essa a estrutura corada com este reagente é ps positivo então essa coloração é principalmente usada para colorir estruturas contendo uma alta proporção de glicogênio carboidratos substâncias que possuem glicose em sua composição o que é encontrado nos tecidos conjuntivos e e muco substâncias produzidas por algo por células que aprenderemos que são chamadas de

células caliciformes ah e também substâncias que estão na membrana basal dos tecidos essa técnica de coloração é muito utilizada para tanto para histologia quanto para patologia pois é usada para ajudar no diagnóstico de várias doenças por exemplo aqui nós podemos ver uma micrografia de uma amostra de tecido de um paciente que foi corado usando o método de ps1 ela ela foi utilizada para tentar identificar um tipo de carcinoma que é chamado de carcinoma de células em anel de sinete tem um adenocarcinoma este tipo de tumor ele secreta mucinas neutras que são carboidratos e por isso

vão ser corados pela técnica de ps1 e com isso nessa lâmina nós podemos ver as mucinas os carboidratos corados na cor magenta e os núcleos das células coradas em azul vamos falar rapidamente de uma outra coloração a impregnação pela prata e esta coloração é também conhecida pelo método de golgi ou coloração com a prata e é uma outra técnica usar em histologia para deixar visível as células visualizadas com o uso de um microscópio esse método é usado para colocar tecidos do sistema nervoso e ela utiliza o dicromato de potássio e o nitrato de prata o

que faz com que haja uma reação onde ocorre a deposição de cromato de prata que resulta em um cristal marron o avermelhado como podemos ver aqui no slide e isso acontece em tecidos do sistema nervoso permitindo a fácil visualização de sua estrutura em microscópio óptico e como podemos ver que um neurônio que se curou usando este método bom e com isso podemos observar um microscópio óptico e as estruturas do tecido nervoso aparecem aqui em preto como vocês podem ver nessa micrografia ou marrons dourados algumas vezes e vamos continuar falando agora de uma outra coloração que

o azul de toluidina no e o azul de toluidina é usado para curar ácidos nucleicos e polissacarídeos é um corante básico e por isso cor essas estruturas ácidas por exemplo o núcleo aparece corado de azul enquanto que estruturas contendo polissacarídeos como cartilagem aparece em roxo quando corados por este método aqui nós vemos uma micrografia onde se utilizou o azul de toluidina para mostrar uma neuropatia a vasculite periférica neuropática mas não se preocupe se você não sabe o que é isso o que você tem que saber é que e esse tipo de corante cora ao mesmo

tempo ácidos nucleicos em azul e polissacarídios em roxo e a próxima coloração da nossa lista é o tricrômico de masson e esta coloração conheço este nome porque ela ela é tem o que chamamos de efeito triplo ou seja essencialmente resulta em três diferentes contrastes e por exemplo com essa técnica estruturas basófilos como ácidos nucleicos se cortam em azul colágeno normalmente corado em verde ou às vezes em azul também estruturas como citoplasma eritrócitos queratina e músculo são cobrados em vermelho essa micrografia é um exemplo de uma mostra corada usando este método nós podemos ver aqui o

citoplasma o músculo corado e vermelho apontado pela seta ah e também no centro da lâmina eritrócitos também corados em vermelho e vocês também conseguem ver e além do citoplasma do músculo corado em vermelho também conseguimos ver núcleos de células coradas em azul e além disso vocês conseguem ver fibras colágenas do lado esquerdo do slide que também estão coradas em azul e a próxima coloração que vamos falar é sobre o tetróxido de ósmio e o tetróxido de ósmio é usado para curar estruturas como gorduras mielina e complexo de golgi apesar desse corante ser ótimo para curar

gorduras também é muito tóxico e por isso protocolos bem restritos são utilizados no laboratório quando estamos trabalhando com tetróxido de ósmio aqui a gente vê uma eletromicrografia de um tecido de uma planta que foi corada com o tetróxido de ósmio mu e para que a gente pudesse visualizar as membranas lipídicas e vesículas olá neste tecido e essa técnica é normalmente utilizada em microscopia de transmissão e esse é o último corante da lista da nossa lista de colorações que vamos ver aqui obviamente existem mais corantes que podem ser utilizados que são específicos para determinada estrutura celular

a principal mensagem deixada aqui é que as diversas os diversos tipos de coloração possibilitam a visualização de estruturas microscópicas de acordo com suas propriedades químicas e com isso facilitam a observação de células e tecidos agora vamos falar um pouco como examinar os cortes histológicos já preparados ao microscópio óptico e vamos dar algumas dicas básicas de como é examinar esses cortes ao microscópio óptico e muitas vezes em preparações microscópicas ou lâminas histológicas estudantes cometem erros quando vão identificar estruturas ou se orientar na lâmina pode parecer bem confuso e frustrante e isso é compreensível pois a maioria

dos estudantes está acostumado com a visão macroscópica das estruturas como como por exemplo aqui as artérias da cabeça do pescoço e nós estamos acostumados a velas macroscopicamente e não estamos acostumados a olhar a sua estrutura microscópica essa lâmina mostrando sangue não se parece em nada quando a tô mia macroscópica então isso tudo pode parecer um pouco confuso existem várias técnicas diferentes como as que nós vimos agora de colorações usados nas preparações que mudam o contraste dos tecidos das células e aí a confusão aumenta mais ainda bom então não se preocupe vamos dar algumas dicas básicas

de como examinar uma lâmina ao microscópio antes de você começar e observe as a lâmina a olho nu para determinar o formato da sua preparação como podemos ver aqui isso pode parecer um pouco trivial mas olhar para lâmina antes de colocar lá no microscópio vai te ajudar muito a se orientar depois aqui por exemplo vemos uma preparação um esfregaço de sangue e conseguimos ver macroscopicamente o formato da preparação e em que local da lâmina está contida essa preparação o outro exemplo pode ser visto aqui nessa secção transversal é uma preparação de alguma estrutura em formato

de anel se você notar isso antes de colocar a lâmina no microscópio você está um passo à frente no reconhecimento dessas estruturas e da sua preparação após a identificação a olho nu coloque sua lâmina no microscópio e o calibre este microscópio e tente focalizar a sua imagem para que esta não fica embaçada e comece com a menor magnificação o menor objetiva de menor aumento é isso uma vez que a lâmina sempre é maior do que a lente percorrer toda a lâmina com a objetiva de menor aumento e depois de olhar lá com objetiva de menor

aumento passe por uma objetiva de maior aumento passando para o nível e sempre lembrando se de focalizar a imagem para que ela não fique embaçada e você pode fazer isso várias vezes para ver uma magnificação cada vez maior na sua lâmina e como estamos fazendo aqui e aí o ou seja após colocá-la no maior aumento sempre focaliza a imagem novamente é uma vez que você já teve oportunidade de olhar para sua lâmina e para as estruturas da sua preparação escreva uma descrição das estruturas maiores e menores que você encontra na lâmina raspando vamos fazer isso

aqui e olha nessa lâmina conseguimos observar alguns vasos sanguíneos ah e também podemos ver células epiteliais que aprenderemos um pouco mais sobre elas nas próximas aulas elas aparecem como células colunares e localizadas aqui nós conseguimos visualizar também uma área contendo o tecido conjuntivo contendo muitas fibras colágenas ó e aqui do lado temos um espaço sem ter sido nenhum um espaço vazio é mas é esquerda na lâmina nós conseguimos visualizar o tecido contendo cartilagem bom e com isso nós percorremos todas as estruturas que conseguimos visualizar na lâmina muito bem você conseguiu e aí e depois que

você fez suas anotações sobre estas estruturas você é capaz de ver e o identificar na sua lâmina a próxima coisa que é o tipo de coloração ou talvez o tipo de corte secção o processo de preparação que foi usado para preparar esta lâmina vamos tentar fazer com essa e vamos ver se as colorações que já descrevemos anteriormente batem com alguma delas bate com a nossa lâmina que foram a hematoxilina eosina e aí e o ácido periódico de schiff e a impregnação pela prata e o azul de toluidina o tetróxido de ósmio oi e o tricô

mico de manson e como você pode ver e essa técnica de tricrômico de masson se parece um pouco com a lâmina que nós estamos examinando bom então acho que descobrimos pois nossa lâmina também tem uma coloração do tipo tricô mico é um tricô mico de lei do filho que é comumente usado para ver músculo colar e colágeno e diferenciar tecidos conjuntivos de outras estruturas o ok agora que nós vimos a lâmina no microscópio identificamos o tipo de coloração tá na hora de juntar todas essas informações e tentarem identificar o que está nesta lâmina e agora

vamos tentar identificar as estruturas e talvez adivinhar de que parte do corpo esta lâmina é olhando para coloração three como é fácil ver tecido conjuntivo e vasos sanguíneos também vemos cartilagem hialina encontrada em locais limitados do corpo incluindo debaixo da pele do ouvido conectado ao septo nasal no nariz na traqueia e nos tubos respiratórios menores na forma de anéis estruturais e na estrutura de formato irregular da laringe e nas superfícies articulares lisos dos ossos nas articulações sinoviais e se nós nos lembramos do formato geral da preparação da lâmina nós podemos ver é um formato de

anel completo alguma ideia formato da preparação nos dá uma pista elimina a possibilidade da lâmina ser uma amostra de cartilagem nariz ou de ouvido bem como da superfície articular de um osso e provavelmente não é laringe já que ela tem uma forma tão irregular e a traqueia e os tubos respiratórios menores tem um formato de anel característico bem como cartilagem hialina e também existem vasos sanguíneos correndo através da lâmina o que nós podemos ver aqui e a borda irregular das células epiteliais na abertura o lume e as camadas grossas de tecido conjuntivo profundamente bem acho

que você já descobriu qual é essa preparação não é é isso mesmo é a traqueia esta lâmina é um corte de traquéia agora note informações adicionais como funções das células funções dos tecidos e do órgão lembre-se a forma está relacionada com a função mesmo a nível microscópio bom então é isso aí pessoal tchau e até a próxima vídeo aula e aí e aí