S02_V03 - Espectrofotometria

e a espectrofotometria é o principal método utilizado no laboratório de química clínica por isso falaremos dele de forma mais detalhada e aqui temos três equipamentos um espectrofotômetro manual um analisador bioquímico semi-automático sado e um analisador bioquímico semi-automático lado se eu consigo fazer o mesmo exame nesses três equipamentos como por exemplo determinar a concentração de glicose de uma amostra ou determinar a concentração de colesterol de uma mostro específica bom então esses três equipamentos embora eles tenham características distintas os três equipamentos utilizam o mesmo princípio de funcionamento o que é a espectrofotometria a principal diferença entre eles

estará associada com a capacidade de processamento de amostras o princípio geral do funcionamento de um espectrofotômetro ilustrados nessa figura tão toda espectrofotômetro vai ter uma lâmpada pode ser de tungstênio por exemplo então essa lâmpada ela vai me emitir uma onda policromática nessa faixa de comprimento de onda que compreende a faixa do visível essa onda eletromagnética vai atravessar a amostra e como resultado uma luz emergente vai a atravessar essa mostra vai sair da amostra e vai ser detectada pelo foto multiplicador o sistema de detecção e a luz emergente sempre será melhor do que a luz incidente

em virtude de alguns fenômenos que vão acontecer como por exemplo o número de reflexão então algumas ondas vão bater nessa superfície e vão ser refletidas por exemplo fenômenos de dispersão então partículas maiores dessa minha mostra como limpa proteínas por exemplo ou proteínas de peso molecular elevado então a luz pode bater essas partículas maiores e sofrer desvios importantes é uma parte da luz vai a passar pelo fenômeno de absorção que diz respeito à característica específica característica química das moléculas da que dependendo do comprimento de onda da luz pode ser que essa molécula absorva parte dessa radiação

eletromagnética em algumas moléculas absorvem luz em comprimentos de onda específicos como por exemplo a coenzima na dh absorvem luz na faixa de 340 numetro ao passo que a bilirrubina absorvem luz na faixa de 450 nanômetros por exemplo então na química clínica a gente sempre vai ter um esquema desse tipo eu vou ter de forma geral o meu analito de interesse que vai passar por uma reação química então vai reagir como um determinado reagente r gerando um produto p bom então a molécula que absorve luz muitas vezes é o produto p bom então aqui por exemplo

esse produto p pode absorver luz na faixa de 550 nanômetros por exemplo e aí o meu método vai conseguir calcular a concentração do analito com base no valor de absorbância que eu estou menino através de p e é importante bom lembrar que a luz que ensine na mostra é uma luz monocromática então eu falei anteriormente que a minha lâmpada vai emitir onda policromático ou seja vai emitir em um amplo espectro de comprimentos de onda e aí um dispositivo conhecido como monocromador vai ser utilizado para selecionar uma faixa estreita de comprimento de onda então vamos supor

que a molécula que eu vou medir absorve luz na faixa de 550 nanômetros ok então o meu monocromador vai ajustar para que dê preferência somente luz nessa faixa de comprimento de onda 550 passe e ensina na amostra ok então como é mostrado aqui nesse gráfico eu tenho um pico a transmitância ou seja um pico de luz na faixa de 550 entretanto o meu monocromador tá permitindo a passagem de luz desde 530 nanômetro até 570 nanômetros tá então esse esse essa faixa o gui passagem né que ele chama de banda de passagem é importante porque ela

vai refletir a performance do equipamento ok principalmente a questão da especificidade do meu equipamento do meu sistema ok então nesse caso aqui eu tenho uma banda de passagem que vai de 530 até 570 muito embora o comprimento de onda nominal ou seja o comprimento de onda do mesmo interesse que eu quero medir é 550 nanômetros então quanto mais estreita quanto menor for a banda de passagem do equipamento melhor será esse equipamento e a terceira parte do espectômetro é o detector então o detector geralmente ele tem a associado a ele um fotomultiplicador então a ideia aqui

é os fotos presentes nessas nessa nessa luz emergente aqui o foto ele vai transferir a sua energia para os elétrons dessa placa os elétrons ao receber essa energia eles vão saltar né efeito fotoelétrico nome disso eles vão saltar dessa placa e aí vão colidir com elétrons dessa outra placa e aí o zelo nos vários elétrons dessa placa também vão ser energizados alto e colidem com os elétrons dessa e de modo que isso vai acontecendo de forma sucessiva e o sinal vai sendo amplificar então essa é a função do fotomultiplicador é amplificar o sinal e essa

característica vai estar associada com a sensibilidade do meu espectrofotômetro é importante fica claro que o espectrofotômetro ele mele de fato a transmitância oi e a partir dessa transmitância o equipamento calculado sua arrogância então a veja aqui a luz emergente é justamente a luz que foi transmitida através da mostra que essa luz é lá vai bater no detector ok então o que o equipamento está de fato detectando aqui é a luz transmitida ou seja a transmitância então ele pode quanto e ficar essa transmitância fazendo uma relação entre a quantidade de luz que chegou no detector é

luz emergente sobre a quantidade de luz incidente ok então se eu multiplicar isso essa razão aqui por sei eu voltei a minha transmitância em percentual então a partir desse valor de transmitir antes eu posso aplicar essa forma aqui ok 2 - o logaritmo da transmitância na base 10 e isso vai me dar o valor de absorbância é importante que isso fique claro porque geralmente a gente utilizar o valor de absorbância que o equipamento nos fornece tão importante lembrar que as absorbância calculada e o que o equipamento mede de fato é a transmitância oi e aí

a lei de lambert-beer ela e fala aqui a concentração de uma substância é diretamente proporcional a absorbância tu essa lei ela ela é colocada de forma muito simples a partir dessa equação aqui que fala que absorbância = absortividade multiplicado pelo caminho óptico multiplicado pelo valor e concentração na minha mostra então essa absortividade ela é uma constante de proporcionalidade então ela é uma característica específica da molécula que eu tô mentindo ok então se essa essa essa constante esse valor dessa constante for expresso em unidade de massa por volume eu chamo isso de absortividade se essa constante

tiver expressa em molaridade ela recebe outro nome específico conhecido o coeficiente de extinção olá ou absortividade molar então essa é uma constante esse fica da molécula que eu tô medindo o caminho óptico ele basicamente é a distância né a espessura da cubeta na verdade ou seja um caminho que a luz vai percorrer para atravessar mostra então isso geralmente é padronizado as cobertas tem geralmente um centímetro e caminho óptico tá e a concentração é o parâmetro que eu vou estar geralmente interessado tá então como eu tenho o caminho óptico algo que não varia a assertividade também

uma constante não varia então ao passar a mostra no meu aquipamento eu consigo descobrir a concentração porque o equipamento vai me dar o valor de absorbância oi e aí pela lei de lambert-beer fica claro que a relação entre a absorvância e concentração é linear ou seja isso é muito importante porque isso simplifica bastante os cálculos então se eu pego por exemplo um padrão é um sejam a solução o que eu conheço a concentração do analito então vamos supor nesse caso vou dizer que o meu hálito tá aqui no a concentração de 4 gramas por decilitro

então eu passo esse padrão no espectrofotômetro faço a reação né para medir esse esse andamento e aí como o resultado eu passo isso no espectrofotômetro e ele me dá um absorvância de 0,210 por exemplo então esse que a pessoa pode ser de 0,250 respondem a concentração de 4 e vamos supor que eu quero descobrir qual é a concentração desse analito na minha mostra bom então eu posso pegar essa mostra né fazer a mesma reação utilizar o reagente nele detecção e isso por exemplo poderia me dar um absorbância de 0,65 bom então sem fazer nenhum cálculo

de cabeça mesmo você pode observar aqui o valor de 0,65 corresponde à metade do valor de 0,210 então como a relação é linear a você pode inferir que a concentração do analito nessa bosta é a metade da concentração do padrão ou seja 2 gramas por decilitro tá então assim simples desse jeito então em forma geral se você quiser fazer um cálculo né caso os valores não sejam tão óbvios assim basta fazer uma regra de três simples a então absorbance de 210 corresponde a concentração de 4 gramas por decilitro e absorbância 0,105 a minha mostra vai

corresponder a qual a concentração vamos fazendo essa continha simples você conseguiria descobrir a concentração a ser um analito de interesse dessa mostra