nella scorsa lezione abbiamo visto che il genoma è l'insieme di tutto il DNA presente in una cellula Diciamo che ora vogliamo verificare se uno specifico frammento di DNA un gene ad esempio si trova in un determinato genoma per fare questo abbiamo bisogno di una tecnica di laboratorio chiamata sou Blot occupiamoci adesso Allora proprio del southern lot [Musica] il saud Blot è una tecnica di blotting Fra poco Vedremo cosa significa utilizzata per rilevare la presenza di una specifica sequenza di DNA all'interno di un campione costituito da una miscela di molecole di Dna come nostro solito analizziamo
il nome in merito alla prima parte sauder possiamo dire molto poco di utile perché è semplicemente il cognome dell'inventore di questa tecnica Edwin sauter la seconda parte Blot invece può aiutarci un po' di più tenete a mente che Blot significa macchia e fra poco nel terzo step della Tecnica capiremo come questo ci aiuti ora il southern Lot è una tecnica che parte dall' elettroforesi su gel di campioni di miscele di DNA digeriti con enzimi di restrizione abbiamo già parlato di elettroforesi su gel nella lezione 156 e lì abbiamo visto che questa tecnica sfruttando il fatto
che le molecole di DNA sono complessivamente cariche negativamente e hanno la stessa quantità di carica per massa serve a separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni lì abbiamo fatto correre su gel campioni di DNA derivanti dalla reazione a catena della polimerasi o PCR di cui abbiamo parlato nella lezione 155 abbiamo fatto correre su gel cioè campioni di frammenti specifici di DNA amplificati campioni composti praticamente solo da un gran numero di molecole di uno specifico frammento di DNA la corsa elettroforetica di questo tipo di campioni rileva su gel un'unica banda di DNA la
cui posizione ci permette di stimare la dimensione del frammento di DNA amplificato cosa succede se invece del risultato di una PCR facciamo correre su gel il risultato della digestione con enzimi di restrizione di un campione di DNA genomico i frammenti di DNA presenti in un campione così ottenuto sono tanti e diversi tra loro e Allora succede che dopo la corsa elettroforetica sul gel non vedremo una o qualche banda di DNA ma una grande strisciata di DNA il sounder blotting ci permette proprio di distinguere all'interno di questa lunga strisciata di DNA e di trovarci dentro se
presente il frammento di DNA di nostro interesse ma andiamo con ordine e vediamo gli step del sou Blot uno alla volta il primo step è la digestione della miscela di DNA in esame con enzimi di restrizione ovviamente scelti ad hoc per gli interessi di chi sta svolgendo il sou Blot come detto poco fa il risultato di questo Step è un insieme di molti frammenti di Dna di dimensioni diverse il secondo Step è la corsa elettroforetica del prodotto ottenuto dal primo step da questa elettroforesi su gel deriva ripetiamolo una lunga strisciata continua di DNA costituita da
tanti frammenti diversi ciascuno delle proprie dimensioni fin qui nulla di nuovo dal terzo step cominciamo ad addentrarci di più nello specifico della Tecnica nel terzo step del sou Blot si posiziona sopra il gel che ha appena oro un foglio o membrana ad esempio di nylon in questo modo i vari frammenti di DNA presenti nel gel si trasferiscono sul foglio o membrana questo processo di trasferimento viene chiamato blotting Blot l'abbiamo detto prima significa macchia blotting significa macchiare il DNA presente sul gel elettroforetico macchia il foglio membrana di nylon e viene così trasferito su di essa praticamente
la membrana di diventa la Sindone del gel elettroforetico e i frammenti di DNA che in questo modo sono passati dal gel alla membrana vengono lì fissati con un passaggio di esposizione della membrana Ai raggi uv vi starete domandando perché non lasciare semplicemente il DNA sul gel Il trasferimento del DNA dal gel alla membrana è necessario per la riuscita del sauderm Blot perché il gel è debole rispetto alle robuste membrane pensate per il saen brot e non reggerebbe agli step successivi della Tecnica vediamoli Allora gli step successivi al terzo abbiamo finora ottenuto una membrana su cui
sono legati tutti i frammenti di DNA derivanti dalla digestione enzimatica del campione originale separati per dimensioni abbiamo una fotografia delle molecole di DNA presenti nel campione iniziale passatemi il termine fotografia perché non è del tutto appropriato come detto poco fa Infatti sulla membrana non c'è un una rappresentazione della corsa elettroforetica ma c'è proprio il DNA che ha corso sul gel ora per verificare che nel campione originale fosse presente il frammento di DNA di nostro interesse dobbiamo usare una sonda complementare alla sequenza di DNA che stiamo cercando un attimo il DNA che è stato trasferito dal
gel elettroforetico alla membrana di nylon il DNA che è stato blott è DNA A doppio filamento per permettere a una sonda di DNA a singolo filamento complementare al DNA di interesse di legarsi ad esso dobbiamo rendere il DNA blott DNA a singolo filamento ci serve allora di inserire la membrana su cui è legato il DNA derivante della corsa elettroforetica in una soluzione denaturante una soluzione cioè che che permette la denaturazione del DNA una soluzione che permette di separare i due filamenti delle molecole di DNA A questo punto possiamo usare un pezzo di DNA a singolo
filamento complementare al DNA che stiamo cercando per farlo legare adesso e permetterci di vederlo per vederlo non dobbiamo però dimenticarci di marcare la sonda di DNA rendendola visibile per questo motivo la sonda di DNA che usiamo per cercare il nostro DNA di interesse deve essere radioattiva o fluorescente deve essere marcata se il passaggio di ibridazione della Sonda alla membrana avviene correttamente la sonda si appaia solamente con le molecole di DNA presenti sulla membrana che sono perfettamente complementari ad essa ci siamo mancano solamente gli ultimi due step uno stringente lavaggio della membrana appena ibridata per e
eliminare tutta la marcatura residua e la visualizzazione dei risultati dell'ibridazione nel caso in cui la sonda di DNA sia stata resa visibile tramite la radioattività quest'ultimo step comporta l'esposizione della membrana ibridata e pulita Ai raggi x la sonda marcata eventualmente ibridata ci permette a questo punto di vedere la presenza e la posizione e quindi le dimensioni del DNA di interesse sottolineiamo adesso un punto da tenere a mente nello svolgimento e nell'interpretazione dei risultati del souen Blot variazioni nella temperatura di ibridazione o nella soluzione di lavaggio possono alterare la specificità della Sonda a temperature di ibridazione
troppo basse Ad esempio la sonda potrebbe ibridarsi a tratti di DNA che sono solo in parte e non perfettamente complementari ad essa Spero sia tutto chiaro chiudiamo facendo un piccolo passettino oltre in apertura di lezione abbiamo detto che il southern Blot è una tecnica di blotting significa che non è l'unica tecnica di blotting ossia che non è l'unica tecnica esistente che prevede il trasferimento su membrana di campioni che hanno corso su un gel elettroforetico esistono altre due tecniche di blotting che sulla Farsa riga del southern si chiamano Northern blot e Western Lot quando le molecole
che vengono separate su gel elettroforetico e trasferite su membrana sono molecole di RNA parliamo di northern Blot quando le molecole che vengono separate su gel elettroforetico e trasferite su membrana sono polipeptidi o proteine parliamo di western blot ad oggi nessuno ha ancora inventato lisn brot Io non riuscivo mai a ricordarmi queste due corrispondenze poi ho ho deciso di associarle al fatto che nel dogma della biologia le molecole di RNA si trovano più a nord delle proteine RNA nen brot Allora che ne dite come trucchetto pneumonico direi che ci sta No per questa lezione è tutto
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