VÍDEO 2

90 90% de água e 10% de acetonitrilo Nossa já cobertou aqui 1.4 ml por minuto perfeito então assim para rodar um método simples pra bomba era isso que a gente precisa falar para ela que ela tem que fazer tá aqui a gente não coloca nada porque ela não vai pegar nada daqui isso coloco nada ela vai mas é pr só PR limpeza é então não então o canal C dele não vai acontecer nada com ela vai ficar paradinho passar a coluna né é o o agora os outros canais ele vai fazer mas daí o se

wash é de 1 em 1 minuto e lembro que tinha mais dois canais o sle Manager purd e o sle Manager wash só que eles ficam aqui dentro do injetor del tá da bomba é canal a b c e d a gente não vai usar nem o c nem o d agora porque eu quero uma mistura de 90 de água e 10% de acesso são onde os canais estão a bomba vai manter um fluxo bombeo de 1.4 ml por durante a corrida toda você reparem que eu não tenho tempo aqui de eu só vou ter

tempo aqui embaixo aí seria para quando a gente tiver necessidade de fazer Gradiente que é o gradiente lembra mudança da proporção da composição da fase M exemp Eu poderia usar assim 70% no canal a 10% no canal b e outros 10 no C com três Vent diferentes dá opão de até quatro no caso então dá inclusive ó mostrar uma coisa bem legal para vocês bem legal né parar de falar isso né ó eu vou dar uma aul hoje né à noite lá no no YouTube e aí é justamente sobre vase móv e Assis vou dar

um exemplo para vocês olha só que interessante isso daqui lá reunião professora tem castear é isso aqui é um cromatograma 7:3 no nosso canal depois eu é clica no botãozinho para seguir ecreve no canal eu sou pimo cara com isso eu não sou youtuber e mas olha só que interessante isso aqui é um cromatograma real tá E só não sei exatamente Quais são as moléculas mas est usando uma coluna c18 e a tentativa existem alguns direcionamentos para desenvolver o método né Então você já sabe que você vai ter que usar água metanol água setan nitrila

por exemplo e é tentativa e erro não tem jeito na maior parte dos casos faz uma corrida lá com 80% água é 20% metanol por exemplo aqui usaram ó 40% e de acetonitrila e existe uma coisa e com relação à força de solvente que chama mono monama monograma é uma representação de concentrações diferentes de acetonitrilo dis solventes mas quando você pega metanol e THF ele em proporções diferentes Bom dia professora tudo bem em proporções diferentes ele pode te dar a mesma força de eluição então acetonitrila 40% é igual em força em força de eluição 50%

de metanol é igual exatamente a mesma coisa se você trocar um pelo outro a força diluição é a mesma coisa nessa concentração só que tem diferença de solvente o metanol é mais é ácido do que a acetonitrila ér mais básica do que então essa acidez basicidade influencia na separação cromatográfica também então isso aqui foi um teste que foi feito durante o desenvolvimento de método se vocês notarem tem cinco Picos cromatográficos aqui dois deles estão saindo junto que é tudo que você não deseja na cromatografia então vamos fazer um teste com metanol só que na mesma

força 5050 isocrático que que aconteceu separou os dois aqui e juntou os dois aqui aí aquela hora que você já começa a ficar bravo né Vamos falar outra coisa é o que que é recomendado você fazer e aí você pensando aqui nos canais para você não ter que ficar fazendo mistura fora coloca água aceto no b c com metanol 100% e o d com uma mistura sei lá mas aqui no próprio software você consegue manipular então vamos fazer um teste misturando e é que foi que é feito que é o recomendado Então vamos fazer misturando

uma proporção igual desses dois solventes que é de um para um aqui jun outros dois Picos aqui mas Man separ Vamos tentar mudar um pouquinho a proporção deslocar um pouquinho mais opção Se eu mudar de dois para um Aí sim deu certo aqui então por onde eu começo e onde que eu termino né existem alguns caminhos existe uma uma informação bem interessante que é tem um livro de cromatografia chamado sneider de um senhor chamado sneider se vocês procurarem na na Amazon vocês acham facilmente Ele criou um triângulo de seletividade para fazer m em que você

consegue ir fazendo esse chaveamento como se fosse um design experimental para você ter por onde seguir um caminho então vou começar pela Cila troquei para metanol posso usar THF também que são os três solventes mais comuns serem usados deu certo com uma desses três Maravilha vou seguir meu processo não deu certo então vou fazer mistura entre eles e vou testar nos três pontos de intersecção entre eles deu certo em um desses pontos maravilha não deu certo vamos fazer uma mistura com os três dificilmente você não consegue resolver a cromatografia dessa maneira thago Mas é quando

eu sairia por exemplo Ah o isocrático não tá dando certo vou pro Gradiente ou não tem então aí tem outras duas ferramentas que são eh que impactam muito nessa operação cromatográfica também essa aqui seria um uma ferramenta inicial a segunda ferramenta seria o gradiente você pode colocar mudança do da da composição do faz móvel separar melhor na mesmo no mesmo tempo de retenção Onde você tá tendo coeli desses Picos para poder tentar separar eles melhor tá e a última ferramenta que é uma das mais potentes é acidez e basicidade da fase M daí você impacta

muito na separação Car tá isso aqui ó é um cromatograma não sei se dá para ver bem deixa eu colocar aqui no modo apresentação meio devagar a internet já pega essas partes que eu vou divulgar antes a aula pro Tiago tá fazer um spoiler internet Ah é verdade né é não mas é bom não é eh efeito da mudança do PH na fase móvel tenho aqui sei lá 12 Picos né tão vendo lá 12 12 Picos diferentes com 10 milimolar de é hidróxido de amônia PH da fase móvel 10.6 Então aquela coluna xbd suporta isso

e é um teste daí cas vai ser feito então você pode testar tanto a composição fase móvel você pode testar depois a além da composição do fase móvel extremos de PH para ver como que o se amó se comporta também então dá para desenhar um experimento sabe para você não errar mesmo porque senão o número de variáveis é muito grande então vamos fazer m para onde que eu vou né tu faz um de cada vez 10 eh de de PH ácido fórmico 2.9 de PH olha as inversões de de pico então o pico que saí

aqui ó o cinco que saí em menos de um minuto e um PH é baixo ele passou a sair com 3 minutos aqui tá bem claro que ele não tinha nada de retenção provavelmente ele tava na forma ionizada aqui se eu tô usando uma coluna c18 então ele tá na forma ionizada não tem interação com c18 não consigo reter ele sai rapidamente primeiro pico troquei o PH você desloca o equilíbrio químico e ele fica na forma molecular interação hidrofóbica faz a interação fica fica retido E aí sim você consegue ter separação então assim é é

é recomendado você testar nos extremos E aí depois você pode ir fazendo diferentes variações eh a parte de desenvolvimento de meta é bem extensa assim bem é não é só passar interessante uma sequência a uma primeira opção ten do esp ali então uma primeira opção é variar solvente porcentagem de solvente uma segunda opção gente Gradiente e a terceira é o PH é seria na ordem isso ou não tem ordem cer é não não necessariamente é por isso que assim ó se vocês tiverem uma classe de molécula e conseguir levantar na literatura algum Norte é é

o melhor dos mundos Porque de fato aqui é uma confusão del eh eu sei que fenólicos por exemplo numa fase ácida ele vai um pouquinho melhor do que na básica só que você pode ter compostos lá tá que aí não sei quais compostos Mas eles podem responder melhorar um pouco mais alto que o importante é ele é que ele faz a interação com a as bolinhas lá né exatamente ele tem ele tem que ter interação ele tem que ter seu composto ele tem que ter tem que ficar retivo el você tem que abrir a molécula

para saber como é que ela eh quando é que ela possa eh eh grudar então tem moléculas que são fechadas né se você conseguir abrir com nph você pode abrir muitas molcas aí ela enca perfeito s é e e é interessante isso B cara é sim é uma loucura isso aqui tá mas é um caminho Assim vocês usando bem essas três ferramentas força dissolvente depois A Gradiente e depois o aditivo Por que que o aditivo talvez Fique por último né ou má ainda não né você vai ass ficar ph3 tem que colocar pouquinho ácido FM

dentro da fase no e você vai CONSEG chegar no th3 mas tem alguns casos que para você manter a reprodutibilidade você vai ter lançar molho usar um tampão e ajustar o PH aí começa o b porque um tampão aqui você pode usar não é impedido nada só que o sal e o sal se você errar ele precipita e onde que é o o erro e a precipitação né o erro seria geralmente em alguma proporção de fase móvel que ele que gera né então um sal com 100% de orgânico exemplo ele precipita na maior parte dos

casos ou mesmo uma proporção menor até 70% de orgânico já é suficiente para precipitar só que lembre-se HPC é inimigo de partícula E aí precipitou esse sal lá e é uma partícula pode ficar preso no filtro pode ficar preso no pistão que faz bombeamento na bomba e aí você risca o selo tem vazamento tem vazamento consegue manter o fluxo tem que tropar o celo então é um pão n é uma ferramenta boa de você precisa usar só que precisa saber usar porque tem que tomar alguns cuidados com ela me lembro no final da graduação Comecei

a usar apc minha orientadora lá na época falava assim tio você vai ter que usar tinha que usar não tinha o que fazer a cromatografia só saia boa se ajustasse o PH e só que fazia análise durante o dia todo como é que você mantém o PH da fase móvel sem tampão não manté então tinha que usar tampão terminava de usar fazer a limpeza adequada daí no equipamento vamos falar de limpeza depois no próximo passo tá beleza sen não vai ficar é coisa e coisa e coisa aqui para vocês aqui ó lembra que eu falei

ontem da força dos solventes Então tá aqui ó eh cromatografia de de fase reversa cromatografia de fase normal e cromatografia de convergência que é um outro tipo de separação que tem que vai também pressão eh gás vai gás pressurizado aqui na na separação cromatográfica também fase reversa é limitada ó água metanol etanol isopropanol e acetonitrila acho que eu errei ontem né Falei acetonitrila Anes de isopropanol eu acho né aqui ele tá numa escala de polaridade de fato tá e não eu acho que eu não errei não ó tá vendo que tá é não tá na

ordem não águaa depois é metanol depois etanol isopropanol é o último você falado do água metanol etanol certo né thl Não lembro ISO não mas é ele tá aqui nessa escala ó do Eta aqui ó tá vendo esse grau aqui ele seria a capacidade de eluição e relativo a uma uma fase estacionária Então quando você considera uma fase estacionária polar a água que é o mais polar de todos depois vem o metanol depois é acho que tá certo sim é isso aqui mas só para exemplificar para vocês que que isso é isso na prática que

vocês vão fazer aqui pra gente não se alongar né fluxo e proporção de fazer móvel tá tranquilo isso quero fazer um Gradiente tá lá no artigo lá fez fez o gradiente com 10 minutos de 0 a 10 minutos ficou 90 a 10 de 10 minutos a 20 trocou para 50 50 como é que eu faço isso aqui você vai clicar na linha de baixo aqui a linha mesmo ou não a linha mesmo aí você não pode clicar aqui ó embaixo do Inicial embaixo do Inicial você colocaria o tempo então eu acabei de falar e em

10 minutos ele vai manter 90 10 Então coloca 10 minutos aqui 90 10 só que eu quero que ele com 20 minutos pode deixar essa linha assim e com 20 minutos que ele V trocando o solvente de 10 a 20 minutos então coloca 20 aqui só que eu quero que ele troque agora ah 50 50 eu quero com 22 Minutos quero que ele troca para eh 1090 programação eu quero que com 23 não vamos até 30 minutos aqui 30 nessa mesma proporção daí de 30 31 ele volte para 9010 E aí até 40 minutos 9010

vou explicar por de tudo isso aqui tá ah ah não dá pra gente ver a curva como que ela fica clica aqui ó nesse Icone Zinho Ah isso era isso mesmo é um gráfico olha só e bom Gradiente a gente faz para poder aumentar mesma força dis solvente Então e o objetivo disso é eluir as moléculas que podem estar presas lá né retiras porque eu sempre desejo que tenha retenção mesmo né é um dos princípios daat F precisa ter retenção da molécula interação com a facee estacionária Mas até quando até quando eu quiser e o

que que eu faço para poder tirar ela de D da coluna vou aumentando a força desse solvente orgânico por que que eu coloquei isso aqui para mostrar algumas coisas para vocês ó geralmente o começo da corrida de fato é o ideal você manter uma alta proporção de água na fase reversa porque você mantém essa retenção um pouquinho maior isso aqui você pode ir ajustando depois eu quero diminuir o tempo de corrida você pode ir diminuindo e ajustando esse Gradiente Aqui de acordo tá mostrei para vocês ah coloquei aqui né o 50 50 para mostrar para

vocês reparem que ele sempre tá indo linear a a é gradativo conforme o tempo passa quem manda na linearidade de troca de solvente é esse número aqui que é uma curva de Gradiente que é uma outra coisa uma outra situação ela vai de 1 a 11 então A1 significa que ela trocaria 100% pro canal né porque que você tá querendo no tempo Inicial e 11 só no tempo final e aí as os números no meio do caminho ele vai fazendo variações pra gente sobre isso [Música] eh e recomendo que vocês usem sempre o seis por

enquanto é é utilizado a cura de Gradiente em casos extremos de separação o toque do toque do refino da Separação cromatográfica isso é raro de acontecer Tá mas só para exemplo ficar se vocês você clicar aqui Bianca em qualquer lugar eh qualquer lugar não vamos É pode ser no de Sobe aqui um pouquinho de 20 a 22 aqui ah esse aqui no 20 Pode colocar uma curva três aí depois você ver o que acontece Ó lá tá vendo que ele troca a forma de trocar o gradiente também tá por isso que vamos de linear para

não ficar confuso aqui tá que que mais é importante daqui repare que ao final ele voltou pra condição Inicial e ficou durante um tempo é um equilíbrio químico dentro da coluna então é uma fase mula que tá passando lá quando você troca esse solvente ele também Troca esse equilíbrio dentro da coluna cromatográfica mas é uma coluna com cilindro cheio de parazin lá ela precisa de um tempo para poder estabilizar por isso desse tempo aqui tá senão a hora que isso aqui acaba ele faz uma nova corrida só que dentro da coluna cromatográfica tá uma outra

fase móvel aí vira uma confusão porque o equilíbrio ainda não tá estabilizado E aí você tem falta de reprodutibilidade de cromatográfica então respeitem sempre um tempo longo thgo mas não dá para calcular esse tempo dá toda coluna cromatográfica é um cilindro tem um volume então dá pra gente calcular o volume da coluna i r qu coisa assim uma coluna para entrar em equilíbrio ela tem que passar pelo menos uns 20 volumes da coluna então teria como a gente calcular isso tá tem gente que calcula certinho se V ficar atando tempo é ou então vocês deixam

um tempo suficiente aqui de 10 minutos a maior parte das colunas vai ser suficiente para estabilizar tá é 5 minutos isso varia de acordo com o tamanho da coluna em si tá como que você sabe que tá estabilizado visualmente assim diretamente quando a gente colocar um método para rodar ele vai gerar um fluxo e uma pressão no sistema né essa pressão ela fica variando de acordo com a viscosidade da fase móvel o fluxo da fase móvel uma série de coisas a amplitude diferença dela a gente chama de Delta então a gente consegue ver o delta

aqui do sistema no no equipamento quanto menor é o delta mais estável tá o meu sistema para esse equipamento aqui um Delta de 15 um Delta de 20 de pressão é suficiente pra gente já falar olha tá estabilizado tá vocês vão ver bastante Delta aqui tá depois Tiago aí tanto o início quanto o final ele sempre tem que ter esses 10 minutos tá tipo estabilizando pra próxima injeção é isso é é não necessariamente 10 minutos mas o o valor que sim mas precisa né pra T começo quant no final tem que ser a mesma sim

tem que tem beleza podemos deletar esses outros aqui agora que nós não vamos então clica na linha mesmo direto e delete n