E aí o olá lu sejam bem-vindos novamente a aula de imunologia Clínica tá dando continuidade aos métodos imunológicos hoje nós vamos ver um pouquinho sobre citometria de fluxo a citometria de fluxo é um método bem importante interessante que a gente utiliza a separação celular tá então a gente vai analisar a célula como um todo nesse método a gente consegue separar primeiramente por tamanho e granulosidade tá isso por células sanguíneas consegue identificar muito bem por tamanho e grandiosidade é um método muito utilizado para Hematologia tá verificação celular caso das células mononucleares vocês podem morte nucleares e a pra imunologia a gente consegue ainda marcar as os subtipos específicos de células tanto em relação a nível de identificação celular e para ver o que que elas estão produzindo em qual fase que as células estão também bom então o método citometria de fluxo ele é um método aqui detectar células e consegue também identificar tá com comentei com vocês na Hematologia é muito utilizada e para identificação nós vamos utilizar fluorocromos associado anticorpos monoclonais é Relembrando anticorpo monoclonal anticorpo obtido né por meio da fusão de células tumorais com um determinado anticorpo específico então por exemplo nós temos a anticorpos monoclonais somente contra uma porção de um antígeno de um micro-organismo tá em todos os anticorpos monoclonais são muito utilizados na prática Clínica tá imunológica é outra mesa de Diagnósticos para citologia é prestar o logia porque são de Corpos específicos contra um determinado região repito de um determinado antígeno então a identificar muito bem Qual o tipo tecidual que é tá então a gente marca especificamente as células elas devem ser Preparadas para a adição desses anticorpos então pra gente conseguir obter realmente onde corpo bem específico a gente deve fazer a utilização né de métodos que separe célula a célula Tá então a gente não pode ter grupo celulares não pode ter tecidos ainda Associados porque é o fluxo que vai passar de ar tem que identificar célula a célula a seguinte consegue realmente identificar porções inteiras senão até mesmo esses grupos podem entupir o equipamento né que vai identificar e não a gente a perna da capacidade né funcional desse aparelho então é a gente que tem que separar realmente né célula a célula para isso então gente várias o ginásio que se for um tecido a gente vai conseguir separar celular célula ou se for preciso sanguínea né é mais fácil porque a gente não tem agregados celulares para encher conseguir realmente identificar a gente tem que passar isso por um aparelho tá que é chamado citometro tá esse toma então ele vai aspirar uma certa quantidade de dia mostra essa mostra vai passar por um fluxo de ar e esse fluxo de ar ou de Salina né ele vai identificar principalmente por tamanho granulosidade se for utilizado um método imunológico a gente vai conseguir identificar né qual tipo celular específico é e ainda a gente consegue marcar entra celular dependendo aumentando a permeabilidade da célula a gente modifica né Essa permeabilidade fazendo com que o anticorpo a dentro da célula e se ligue as substâncias específicas produzidas no interior celular Ah tá então como que acontece a entrada no aparelho e detecção é o primeiro essa mostra né que tem que estar é células ela separar de mim tá a gente vai conseguir obter isso utilizando alguns kits para separação celular ela vai ser aspirada pelo sistema de pressão uma câmera de fluxo então quando ela é aspirada essa esse fluxo ele vai aplicar para ser mente um leizer se consegue identificar aqui que é amostra ela vai ser bem separadas celular célula célula Tá e elas vão passar por um fluxo aqui tá Então tem um fluxo hidrodinâmico vai empurrar essa célula para região mais central e nós vamos ter laser né com comprimentos de onda diferentes Então dependendo do que sintomas que vai ter esse tipo de comprimento de onda que vai refletir nessa célula e vai ser captado tá vai ser e por sensores esses sensores então bom ajudar a identificar a fluorescência é emitida nessa célula Então se vê que têm por essência de diferentes para cada tipo de sensor aqui então elas vão a passar por um leizer e detecta a emissão de luz tá que vão passar por esse foto multiplicadores que são sensores aqui e depois ela vai cair em um recipiente geralmente é um lixo mas tem outro método que ainda a gente utiliza né é que é um de separação que me chame de sorte tá eles e para as células e específicas que a gente identificar para ele então a eu quero linfócitos e C4 marcado então gente vai marcar os tipos de células e todos os células T CD4 vão né para um fluxo de ar específico e caindo tudo especificamente consegue separar determinado subtipos celular bom então Quais são os fluorocromos mais utilizados para citometria Lembrando que o fluorocromo é uma substância que vai ter em estilos e diferentes comprimentos de onda tá então a gente vai emitir o laser de excitação tá E vocês vem que os fluorocromos aqui eles têm né nomezinho diferentes fixo Alexa percipi b. a. p.
cê tá E eles vão ter comprimentos de onda Diferentes né é de perto do cartão de licitação ele tem um comprimento de onda 488 na maioria deles e outras 633 tá então eles têm comprimentos de onda diferentes [Música] entre alguns deles e aí missão né vai ser diferente para cada um então é Alguns podem ter uma missão que a se contrapõem com outros então às vezes a gente tem que o melhor quais tipos de flor cromos que serão utilizados corrente marca de mais de um daí transporte utilizar mais de uma marcação e tem que realmente ver se eles não não se interessa que tá Então vão ter comprimentos de onda que vão sobrepor um ao outro porque isso fica mais difícil para a identificação de qual molécula que está sendo emitida a essa determinada a luz tá então para marcação celular a gente vai utilizar primeira Separação das células e a gente vai utilizar então anticorpos marcados diferentes tipos de anticorpos né marcados com fluorocromos diferentes então por exemplo assim eu tenho aquela analisar linfócitos T CD4 reproduzem interferão Gama tá então lembrando nós temos que esse de quatro esse de oito em falso saber se você me diferente de linfócitos você marcar só linfócitos CD3 gente com Oi tá aí para marcar separar para mim fazer quatro 68 A gente consegue marcar é um anticorpo específico antes de quatro e daí você rapper e um artista de 8 quero ter cytotox para isso é do te rapper a gente pode ter tem rapper 12 17 nov 22 13 então tem vários linfócitos que Diferentes né lembrando dar pouquinho de imunologia básica eu quero identificar por exemplo entrar foram Gama que é produzida principalmente por linfócitos H1 tá então eu consegui identificar se essa célula uniforte t h u entre outros tipos de linfócitos T entre outros tipos de linfócitos e outras células que a gente consegue realmente identificar separadamente dizem que aqui a gente tem os antígenos por exemplo na célula esta celulares e antígenos intracelulares quando a gente em Cuba essas amostras com anticorpos específicos com fluorocromos a notícia esses fluorocromos por exemplo se ligam né Réus anticorpos perdeu se ligam com suas flores cromos específicos os antígenos esta celulares e se você permear as ela tem um método de permeabilidade utilizando tampões diferentes ele vai permitir então entrada de sente corpo com fluorocromos específico para marcar as células que não tem o a substância não serão marcadas acho que não tem antígeno externo não serão marcadas Então o que a gente consegue ver padrões diferentes de marcação por exemplo essa célula aqui ó ela tem um antígeno extra-celular mas não tenho entro eu poderia ser um linfócito tcd4 mas não um produtor de interferão Gama aqui pode ser uma célula produtora interferão Gama mas não CD4 e aqui é uma célula T CD4 produtor de interferon Gama Ah tá é que a gente consegue ver a marcação para as duas substâncias que eu pedi Então são três grupos separados de células que existe obteria nesse caso aqui tá então Vocês entenderam marcação mente a celular e esta com anticorpos específicos permeia e entre alguns anticorpos na no meio entre as celular para fazer determinadas marcações então para análise do teste a gente tem diferença tipo de padrões tá então isso tem gráficos que são analisados de modo diferente Então nesse caso aqui ó a gente pode ter um mono para métrico tá com uma única flor Essência ou com duas flores seis que chamar de bebê para médica dividido em quatro Gates tá só queria saber a figura a tem quatro gays diferença nessa Gate aqui principal aqui é ela não tem a marcação para ser de 11 por exemplo você deu um descer é que a gente marca principalmente perdeu as críticas e aqui é a marcação para MHC de Classe 2 tá então por exemplo todas as células que produzem mk142 ela tem esse corte aqui ó tá esse Thrash old que vai identificar todas as células daqui para cá que tem emergência de quase dois e esse corte aqui ó a identificação daqui para cima todas as moléculas que são se de 11 se positivas Então essas moléculas os aqui que estão nesse 58 por cento elas não tem nem MHC de Classe 2 e nem se de 11 essas moléculas aqui ó Elas têm todas emagrecer de PS2 mas elas não têm cd11c as de 28 por cento essas de 14 por cento elas são cd11c positivas mas não expressa uma mega cê E essas é quase pontinhos só mas pela quantidade de células a gente não consegue determinar uma quantidade suficiente Então ela zero por cento então praticamente não tem células que expressam MHC de Classe 2 e cd11c positivas ser uma marcação por exemplo para células dendríticas no caso tá então lembra nos linfócitos B produzem o mesmo tipo você dois apresentação do antígeno né É E macrófagos e células dendríticas cd11c está expressa principalmente nas células dendríticas ali então a gente não conseguiu identificar e ele tem um outro tipo de padrão aqui tá que pode ser por histograma tá os padrões de histograma são interessantes que a gente consegue ver a expressão de moléculas novas por exemplo aqui ó tem gente mostrando a fluorescência própria tá então é um fator importante as células Elas têm mal A Essência Essa autofluorescence ela tem que ser retirada né no padrão então ele consegue identificar Qual é a fluorescência é própria da célula a gente elimina essa flor essência para a gente identificar somente inflorescência importante para análise de está buscando então alto fluorescência celular ela tem que ser retirada né então a gente consegue identificar Qual é principalmente com padrões né é quando a gente faz utilizar os testes aí sempre tem que ter marca marcadores específicos e inespecíficos né e utilizar também os controles Esse controle de tem somente a célula e essa florescência própria gente consegue retirar tá então até mesmo os padrões marcar a gente consegue ter abrir alto fluorescência Eu por exemplo aqui ó essa marcação que seria para MHC de Classe 2 é então autofluorescência ele vai chegaria até em 10 para 2 a contagem de células tá no gráfico abaixo você vê a quantidade né então na mesma 10. 10.
