em rede nacional de especialistas em terapias avançadas um projeto da Agência Nacional de Vigilância Sanitária em cooperação técnica com programa das Nações Unidas para o desenvolvimento e executado pela Universidade Federal do Rio de Janeiro métodos não virais de transferência gênica [Música] e vamos começar apresentando as principais vantagens e desvantagens desses métodos os métodos não virais de transferência gênica são considerados mais seguros que os métodos virais pois não envolvem o uso de vírus na sua produção reduzindo com isso a chance de Resposta imune e da Regeneração de partículas infectantes por recombinação são métodos não tóxicos e
não imunogenicos e são muito fáceis de produzir se comparado com os vetores virais no entanto são também menos eficientes e mais difíceis de Direcionar para um tipo celular específico por isso aplicação clínica de vetores não virais é bem menos frequente que o uso de vetores virais os métodos não virais de transferência gênica se dividem em métodos físicos e métodos químicos e a seguir veremos um pouco mais sobre os tipos mais utilizados dentro de cada categoria e os métodos físicos usam a injeção direta do ácido nucleico sem mediador químico pode ser feita diretamente pela ingestão de
uma solução com o plasmídeo contendo a sequência de interesse utilizando uma seringa e agulha a injeção direta do plasmídeo em solução fisiológica pode ser usada para transmissão de células musculares inclusive do músculo cardíaco ou da epiderme a eficiência desse método com tudo é muito baixa é a injeção hidrodinâmica é uma variação do método anterior ela consiste em administrar um volume de solução correspondente a oito a dez por cento do Peso corporal em um curto período de tempo entre cinco e sete segundos isso cria um fluxo retrógrado do coração para o fígado que atua Como uma
esponja absorvendo o excesso de líquido através da distensão dos sinusóides a entrada duplas mídia nos hepatócitos ocorre por macropinocitose em camundongos são injetados 2ml pela veia da calda em suínos 100 a 150 ml pela veia hepática ou ver a porta para seres humanos sugere-se a administração de 500 a 750 ml com o uso de um cateter balão para direcionamento aos Lobos hepáticos porém não há estudos que demonstrem a segurança desse procedimento em pacientes o método de jenni Gama também chamado de Bill balística consiste no bombardeamento de partículas o Brasil usadas revestidas com ácido nucleico utilizando
o gás hélio em alta pressão as micro partículas metálicas de um micrômetro podem ser feitas de prata ouro ou tungsténio é usada para transferência gênica intradérmica intramuscular ou entra tumoral a eletroporação consiste na aplicação de uma corrente elétrica de alta voltagem que cria poros na superfície celular que permitem a entrada de ácidos nucleicos a duração do pulso e sua amplitude determinam a permeabilidade da membrana e variam de acordo com o tipo celular é importante que esse processo seja reversível para que as células sobreviva esse método é bastante usado para a modificação das células in vitro
ou seja para terapias gênicas vivo a núcleo infecção é um tipo especial de eletroporação que utiliza parâmetros específicos que abrem poros na membrana plasmática e na membrana nuclear esta técnica utiliza um equipamento isso é um parâmetros e reagentes proprietários no entanto para que tem um efeito terapêutico não basta o ácido nucleico entrar na célula muitas outras etapas devem ser cumpridas ele precisa primeiro vencer o cliente da circulação e chegar a célula-alvo depois ele deve realizar o escape endossomal ou seja sair do Windows como tardío antes de suar solidificação e fusão com o lisossomo caso contrário
será degradado finalmente para a maioria das sequências que atuam no núcleo o ácido nucleico deve resistir à degradação no citoplasma e efetivar a sua translocação através da membrana nuclear os métodos físicos que vimos até agora são muito ineficientes nesses processos pois na sua maioria visam apenas a entrada do ácido nucleico na célula O porém os métodos químicos que veremos a seguir buscam diferentes alternativas para lidar com todos esses aspectos os métodos químicos mais utilizados são os lipídios catiônicos capazes de se fusionar com a membrana plasmática centenas de lipídios catiônicos foram desenvolvidos para terapia gênica todos
possuem uma estrutura comum de cabeça hidrofílica positivamente carregada e uma cauda hidrofóbica a cabeça positivamente carregada se liga ao grupo fosfato negativo no ácido nucleico formando uma estrutura compacta denominada lipoplex a carga positiva do lipoplex faz uma interação eletrostática com as lipoproteínas e proteoglicanos negativamente carregados da membrana celular facilitando a entrada dos ácidos nucleicos polímeros catiônicos são chamados de lipossomas Se tiverem um núcleo aquoso ou de nano emoções se o núcleo oleoso ambas possuem em torno de 200 nanômetros de diâmetro e entre os lipídios catiônicos mais utilizados atualmente estão do Batman e do tacos porém
as cargas positivas dos lipídios catiônicos são tóxicas pela ligação inespecífica com proteínas séricas essa interação limita a circulação dessas moléculas que são rapidamente captadas pelo sistema retículo-endotelial esse problema pode ser contornado com o uso de lipídios neutros Como o colesterol ou doppio a eficiência do Lipo plexo e também só toxicidade é determinada pela sua relação de cargas e pediu DNA que não deve ultrapassar 3 para um polímeros catiônicos como pay Quitosana plg a ciclodextrina e dendrímeros também são usados como vetores não virais para terapia gênica esses polímeros lineares ou ramificados formam complexos com ácidos nucleicos
chamados de polyplex devido à possibilidade de o número extensão das cadeias poliméricas são estruturas versáteis que podem ser adaptadas para entrega de diferentes ácidos nucleicos como por exemplo Sr nas a alta densidade de grupos Amino da polietilenoimina impedem acidificação do PH do endossomo levando a entrada de íons cloreto e ruptura da membrana endossomal com consequente liberação do ácido nucleico porém apoio e Cilene mina é tóxica dependendo da sua estrutura e peso molecular que também interferem na captação celular assim é preciso encontrar o balanço entre essas características que favoreçam a captação celular sem aumentar a toxicidade
para contornar essas limitações são criadas partículas funcionalizados que combinam estratégias para melhorar a eficiência de entrega dos ácidos nucleicos sem aumentar a toxicidade dos vetores por exemplo pode ser os vídeos catiônicos combinados com lípides neutros para redução da carga positiva esses lipídios tem a capacidade de se fusionar com a membrana plasmática porém não são eficientes no próximo passo escape endossomal Mas eles podem recobrir estruturas poliméricas como app que atuam com esponjas de prótons impedindo a cientificação do endossomo tardio mas que são mais tóxicas que os lipídios catiônicos ainda assim esse sistema precisa resistir ao clima
esses Érico uma das maneiras mais usadas para aumentar sua meia-vida na circulação é a adição de um polímero neutro como polietileno glicol Peg ele reduz a opsonização e agregação dos Lipo plexos no sistema retículo-endotelial porém também reduz a eficiência da fusão com a membrana para melhorar a entrada na célula pode-se utilizar peptídeos tecido específicos elegante e onde corpos que auxilia na captação do complexo através de vesículas recobertos por Catrina com esse sistema é possível direcionar o ácido nucleico para as células-alvo e aumentar a eficiência da transferência finalmente a necessidade do ácido nucleico atingir o núcleo
da célula onde poderá ser transcrito ou atuar na modulação do processamento de Mr na ao contrário dos micro RN as ou RNA de interferência que atuam diretamente no citoplasma para o direcionamento do ácido nucleico para o book costuma-se usar uma proteína com sinal de localização nuclear derivada de vírus como a proteína táxi de antivírus ou sv40 de retrovirus essas proteínas são fusionadas com a proteína de ligação ao DNA Como o grau 4 e carreiam ácido nucleico através dos poros nucleares assim as partículas a pesadas permitem o aumento do tempo de circulação o direcionamento o celular
ainda ocitose mediada por quatro mina o escape endossomal a translocação para o núcleo EA expressão do gene de interesse e esta tabela sumariza os principais desafios da aplicação de métodos de transferência gênica não viral e soluções que têm sido propostas para respondê-los o contínuo aprimoramento dessas estratégias irá resultar em vetores mais seguros fáceis de produzir e com eficiência comparável aos vetores virais e
