Abbiamo appena effettuato una PCR Come facciamo a sapere che tutto è andato bene come facciamo a sapere che la reazione a catena della polimerasi ha funzionato utilizzando l'elettroforesi su gel una tecnica di laboratorio che serve a separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni parliamo adesso delle elettroforesi su gel [Musica] l'elettroforesi su gel È una tecnica di laboratorio che serve a separare frammenti di DNA in base alle loro dimensioni e alla loro carica in realtà si può utilizzare l'elettroforesi su gel anche per separare molecole di RNA o proteine ma restiamo sul DNA tutte
le molecole di DNA hanno la stessa quantità di carica per massa e allora l'elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA solo in base alle loro dimensioni come spesso facciamo partiamo dall'analisi dei termini elettroforesi È un termine composto dal prefisso Elettro che si riferisce all'utilizzo di elettricità Nella tecnica e dal suffisso Foresi che deriva dal greco foresis Che significa trasporto su gel perché il trasporto tramite elettricità coinvolge un gel nell elettroforesi su gel i campioni vengono separati facendoli muovere in gergo correre in un gel attraverso l'utilizzo dell'Elettricità Ma andiamo con ordine primo step di una
elettroforesi su gel è non lo direste mai preparare il gel il gel utilizzato nelle elettroforesi è solitamente un gel di agarosio e si prepara sciogliendo ad alta temperatura l' garosio un polisaccaride che viene estratto da un'alga in una soluzione acquosa detta buffer Dopo che l' garosio si è completamente e uniformemente sciolto la soluzione viene versata all'interno di uno stampo per permetterne la solidificazione Ovvero la formazione di una lastra di materiale gelatinoso occhio in questo Step è importantissimo non dimenticarsi di inserire un pettinino di solito di plastica ad una delle due estremità al suo posto nello
stampo il pettinino serve Infatti a permettere la formazione dei pozzetti degli spazi rimasti vuoti Cioè senza gel diciamo dei solchi nel gel che saranno fondamentali nello step di caricamento dei campioni da analizzare prima di andare avanti Vi devo chiedere di immaginare il gel a livello molecolare come una rete di pori questi pori consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza e il gel funge Quindi da setaccio la larghezza delle maglie del gel dipende dalla concentrazione di agarosio nel gel e viene scelta in base al tipo di molecole di DNA che si vuole analizzare
se dobbiamo analizzare DNA di grandi dimensioni abbiamo bisogno di avere pori grandi nel gel in modo da permettere il passaggio di Dna di grandi dimensioni in questo caso scegliamo una concentrazione di agarosio più bassa se dobbiamo analizzare DNA di piccole dimensioni invece abbiamo bisogno di avere pori Piccoli nel gel in modo da aumentare la risoluzione della separazione in questo caso scegliamo una concentrazione di agarosio più alta dopo lo step di preparazione del gel Mi raccomando ai pozzetti questo viene posizionato all'interno di un contenitore per elettroforesi il contenitore per l'elettroforesi detto cella elettroforetica in questo caso
orizzontale è una piccola vasca con un'importante peculiarità è collegato ad un elettrodo positivo da un lato e ad un elettrodo negativo dall'altro per procedere bisogna posizionare il gel solido appena preparato nella cella elettroforetica e versarci sopra fino a copertura del gel una soluzione acquosa detta buffer fondamentale è l'orientamento con cui si inserisce il gel nella cella elettroforetica il lato del gel con i pozzetti deve essere posizionato dalla parte dell'elettrodo negativo il lato del gel senza pozzetti deve essere posizionato da la parte dell'elettrodo positivo posizionato il gel e versato il buffer sopra di esso è il
momento di caricare all'interno dei pozzetti all'interno dei solchi del gel creati dal pettinino i campioni di DNA da analizzare addizionati con un buffer di caricamento la composizione del buffer di caricamento è pensata per appesantire i campioni di DNA in modo tale da farli depositare sul fondo del pozzetto e per permettere allo sperimentatore di seguire visivamente la corsa su gel ed accorgersi di quando la corsa elettroforetica è terminata ultimo step dopo il caricamento dei Campioni nei pozzetti è quello di collegare gli elettrodi alla corrente per permettere alla corrente di iniziare a fluire attraverso il gel e
quindi far partire la corsa elettroforetica ora Se vi ricordate le molecole di DNA sono complessivamente cariche negativamente a causa dei molti gruppi fosfato presenti nello scheletro zucchero fosfato che costituisce i due filamenti del DNA in quanto cariche negativamente le molecole di DNA una volta fatta partire la corsa elettroforetica tendono a migrare in gergo a correre verso il polo positivo i campioni di DNA devono Allora essere caricati al polo negativo della Cella elettroforetica perché in questo modo il DNA può muoversi dal polo negativo a quello positivo ed ecco spiegato perché è fondamentale posizionare i pozzetti i
solchi del gel in cui vengono caricati i campioni di DNA dal lato dell'elettrodo negativo al termine dell'elettroforesi o corsa elettroforetica cioè quando i frammenti di DNA presenti nei campioni da analizzare hanno corso a sufficienza bisogna analizzare i risultati riprendete l'immagine mentale che vi avevo chiesto di farvi del gel a livello molecolare l'immagine di una rete di pori che fa da setaccio questa immagine ci permette adesso di capire perché le molecole di DNA più piccole riuscendo ad infilarsi più facilmente nei Poli del gel corrono più lontano dai pozzetti rispetto alle molecole di DNA più grandi che
infilandosi meno facilmente nei Poli del gel resta Stano più vicine ai pozzetti capito questo concetto alla base dell'analisi dei risultati di un elettroforesi su gel ci manca solo di capire come rendere visibili i campioni di DNA che hanno corso nel gel ci manca Allora di parlare dei coloranti per l'elettroforesi I coloranti per l' elettroforesi sono molecole intercalano molecole che si inseriscono all'interno della struttura delle molecole di DNA rendendole visibili alla luce UV questi coloranti possono essere aggiunti direttamente nella preparazione del gel o essere aggiunti ai campioni di DNA prima del loro caricamento nei pozzetti l'utilizzo
dei coloranti che si intercalano al DNA permette la visualizzazione dei frammenti di DNA sotto forma di bande brillanti all'interno del gel esposto Ai raggi B I DNA ladder infine sono marcatori dimensionali cioè prodotti commerciali che si fanno correre nel gel insieme ai campioni da analizzare e che funzionano da standard in quanto contenenti frammenti di Dna di dimensioni Note un DNA ladder In pratica è uno standard che si usa per comparare le bande di DNA presenti nei campioni con Bande di Dna di dimensioni Note i DNA ladder Vengono venduti corredati da un'immagine leggenda che a affianca
ad ogni banda elettroforetica del marcatore le sue dimensioni in paia di basi la comparazione tra la corsa elettroforetica dei campioni da analizzare e la corsa elettroforetica dei frammenti di dimensione nota presenti nel DNA ladder permette di ottenere una stima delle dimensioni dei campioni di DNA analizzati ci siamo allora bande più vicine ai pozzetti sono costituite da frammenti di DNA più grandi mentre più lontane dai pozzetti sono costituite da frammenti di DNA più corti ma non solo caricando in uno dei pozzetti un DNA ladder dopo la corsa elettrofo letica possiamo confrontare le bande dei nostri campioni
con le bande dei frammenti di DNA presenti nel DNA ladder e stimare così le dimensioni dei frammenti di DNA presenti nei nostri campioni l'elettroforesi su gel allora è una tecnica che serve a rendere possibile la visualizzazione di frammenti di DNA è una tecnica che ci permette di vedere quanti diversi tipi di frammenti di DNA sono presenti in un campione e di stimare le loro dimensioni l'elettroforesi su gel ci permette di analizzare il DNA perché ci permette di vederlo per adesso Vi ringrazio per l'attenzione vi invito a restare connessi con me e con la biologia iscrivendovi
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