Le biotecnologie - Giovanni Maga

bene grazie Allora Buonasera a tutti e Grazie soprattutto per la pazienza con cui siete rimasti e la costanza con cui avete lavorato spero adesso di concludere in maniera non particolarmente come dire pesante visto che so che arriva ad una giornata di lavoro e quindi come dire la fatica comincia a accumularsi Allora tanto per sgombrare il campo da qualsiasi possibile fraintendimento Voi vedete Io non sono un insegnante di scuola superiore quindi non ho nessuna intenzione di venire a dirvi come fare il vostro lavoro nel senso che voi siete i professionisti dell'insegnamento io quello che voli fare

oggi è condividere con voi alcune riflessioni alcuni spunti su un possibile percorso per approcciare l'argomento delle biotecnologie fornendo magari un filo conduttore a quelle diverse tematiche che a volte sui libri sembrano quasi separate una dall'altra in modo dare allo studente anche la capacità di seguire un po' la logica che sottende a questa disciplina Allora secondo me Un primo problema è quello di definizione perché la parola biotecnologie sicuramente evoca in molti ragazzi Magari delle suggestioni diverse e quindi la mia proposta è quella di partire da una definizione condivisa e mi piaceva abbastanza questa che è stata

proposta dall'onu nella sua convenzione mondiale sulla biodiversità che in maniera molto sintetica sapete le definizioni hanno sempre dei limiti No ma secondo me questa è abbastanza come dire azzeccata in maniera molto sintetica dicevo definisce le biotecnologie come delle applicazioni tecnologiche chiaramente e questo già indica come non si tratti di una disciplina organicamente strutturata Come può essere la chimica organica ad esempio quanto piuttosto di un insieme di tecniche applic i cui principi fondamentali sono mutuati da molte discipline voi quando insegnate diciamo le tecniche di base delle biotecnologie in realtà insegnate della biologia molecolare quando spiegate le

applicazioni mutuate concetti dalla biochimica addirittura dall'ingegneria se vogliamo arrivare alle applicazioni più come dire di carattere tecnologico quindi sono delle applicazioni che servono a qualche cosa quindi quando si illustrano le biotecnologie è importante mantenere sempre questo contatto molto stretto tra il diciamo come funziona quindi la tecnica di base e a che cosa serve perché le biotecnologie non hanno nessun senso se non vengono viste nelle loro applicazioni che sono quelle di fornire dei prodotti o mettere a punto dei processi per degli usi specifici quindi le biotecnologie sono uno strumento Eh che utilizza diciamo così tecniche mutuate

da diverse discipline per rispondere a dei bisogni della società ora Sempre in tema di definizioni Secondo me una piccola distinzione va fatta tra la le biotecnologie e più In generale l'ingegneria genetica cosa intendo dire che tutte quelle tecniche che voi illustreret e che servono a manipolare il DNA a modificare l'informazione genetica che sono ovviamente alla base delle applicazioni biotecnologiche tuttavia non sono biotecnologia in senso stretto si tratta cioè delle tecniche di ingegneria genetica che non necessariamente sono rivolte a dei prodotti o degli utilizzi perché sono usate anche per la ricerca di base e quindi secondo

me fornire questa informazione allo studente le biotecnologie utilizzano le tecniche dell'ingegneria genetica permette già di distinguere un attimo tra strumento e applicazione Allora introduciamo subito che cosa fanno le biotecnologie e quindi si possono recuperare alcuni concetti che gli studenti hanno no come quello di genotipo e fenotipo le biotecnologie hanno come scopo quello di modificare l'informazione genetica di un organismo per fornirgli delle caratteristiche che prima non aveva e in termini più rigorosi le biotecnologie modificano il genotipo per ottenere un nuovo fenotipo Allora come prerequisito diciamo a questo concetto fondamentale chiaramente lo studente deve almeno ricordare Qual

è il percorso dell'informazione genetica perché l'informazione del DNA si riflette poi sul fenotipo e quindi ricordare i vari processi di trascrizione traduzione e espressione proteica ora la manipolazione i del genotipo per ottenere nuovi fenotipi non è una come dire applicazione nuova moderna E quindi è utile Secondo me fornire anche brevemente una prospettiva storica cioè da sempre l'uomo ha modificato eh gli organismi in particolare la struttura genetica degli organismi per ottenerne di nuovi che se fossero più confacenti alle sue necessità e quindi a partire dal Neolitico con la domesticazione degli animali o col miglioramento delle prime

varietà coltivate l'uomo ha fatto dell'ingegneria genetica chiaramente con gli strumenti a disposizione e cioè incrociando sessualmente eh diverse specie Allora a me piaceva questo esempio Perché dà un'idea effettivamente della diciamo dimensione delle manipolazioni genetiche ottenute con questo metodo naturale Questa è la pannocchia di mais con cui i ragazzi hanno familiarità e questo è il suo antico precursore il teosinte che era coltivato nel Mes omerica migliaia di anni fa ora tutte queste forme intermedie che sono quelle selezionate man mano nei secoli dagli Agricoltori sono di fatto dei mutanti ovvero incroci di specie in cui c'è stato

un rimescolamento di geni Quindi abbiamo modificato la struttura genetica del teosinte fino a arrivare al mais che ha circa il triplo dei suoi geni ora tutto questo e qui si ritorna di nuovo a recuperare concetti già noti funziona quindi l'incrocio sessuale attraverso le regole di segregazione dei caratteri definite da Mendel da un punto di vista pratico Che cosa vuol dire vuol dire che se noi vogliamo inserire un far emergere diciamo un carattere in una specie coltivata per esempio e lo vogliamo puro ovvero fare in modo che tutte le coppie di questo Gene tutti gli alleli

siano Identici in modo da non avere i problemi dominanza recessività dobbiamo effettuare molti incroci e nel caso del Frumento ad esempio che ha sei alleli Cioè sei coppie di ogni Gene per ottenere una linea pura vuol dire fare circa 280.000 incroci e questo è di fatto l'ordine di grandezza del diciamo lavoro che è stato fatto nei secoli dagli agric Iori e poi più recentemente dagli agronomi per selezionare le varietà che oggi utilizziamo ma chiaramente richiede tempo è un processo stocastico non si sa mai quale Gene viene trasmesso insieme a quello che diciamo ci interessa e

quindi qui si può aprire se vogliamo la prospettiva Cosa fanno le moderne biotecnologie perché sono utili perché grazie all'ingegneria genetica quindi alle tecniche di manipolazione del DNA le biotecnologie sono in grado di spostare solo il carattere desiderato quindi solo quel pezzo di informazione genetica che a noi interessa trasferire anche tra specie diverse che quindi non sono normalmente sessualmente compatibili e in questo modo le biotecnologie forniscono un serbatoio diciamo così di possibile informazione che è grande tanto quanto tutta l'informazione genetica presente nella biosfera Superando i limiti di conseguenza della diciamo ereditarietà mendeliana Allora una volta che

abbiamo chiarito Cosa fanno le biotecnologie E perché rappresentano un vantaggio rispetto alla manipolazione genetica Diciamo in senso classico si può Allora entrare nella parte più tecnica delle diciamole così tecniche di base degli strumenti fondamentali Allora ci si si può arrivare in tanti modi diversi Nel senso che l'insegnante a seconda della sua particolare propensione delle della sua fantasia può anche approcciare la classe con un esempio prende un articolo di giornale in cui si dice è stato clonato il toro tal dei tali Cosa vuol dire e può come dire partire da lì io oggi vi presenterò un

diciamo così uno schema più lineare dove partendo dagli strumenti Eh si arrivi a definire il processo fondamentale che è quello del clonaggio per poi passare alle applicazioni Ma come dicevo è una mia scelta per motivi di semplicità quello che secondo me è importante è che partire dal clonaggio offre dei vantaggi perché la tecnica di base per tutte le applicazioni biotecnologiche consente di introdurre gli strumenti diciamo fondamentali diversi enzimi le tecniche di base ha una grande flessibilità dal punto di vista degli approfondimenti Io posso fermarmi alla tecnica fondamentale o dare qualche piccolo esempio oppure se ho

tante ore ho tanto interesse posso ampliare e io cercherò di darvi qualche suggerimento ovviamente il clonaggio e le sue applicazioni hanno anche delle possibilità di collegamento interdisciplinare quando si parla di bioetica e dei problemi diciamo legati al clonaggio o alla clonazione che è la riproduzione di organismi ci si può collegare con la filosofia io qui ho messo anche le lingue italiano-inglese perché molti dei termini che oggi sono come dire ufficialmente nella lingua italiana sono stati mutuati dall'inglese proprio per definire alcuni concetti base delle biotecnologie che in italiano non hanno una traduzione come dire pronta o

che si sono come dire stabiliti con l'utilizzo gli esempi ovviamente il limite è il cielo con le biotecnologie quindi poi all'insegnante magari selezionare quegli esempi che sono più come dire adatti sia al tipo di scuola che magari all'interesse della classe Quindi ne vedremo alcuni durante questa questa chiacchierata Allora partiamo Quindi dagli strumenti gli attrezzi molecolari con cui l'ingegneria genetica manipola eh Il DNA sono fondamentalmente degli enzimi o delle molecole di DNA particolari sui sui testi sono spiegati in maniera esaustiva quindi non voglio entrare nei dettagli Secondo me però è importante ricordare che sia gli enzimi

che le molecole di DNA che vengono utilizzate per trasferire i geni sono tutti elementi mutuati dal mondo naturale E questo vale un po' per tutte le diverse applicazioni dell'ingegneria genetica e della biotecnologia non si inventa niente si adattano fomi meccanismi naturali ha delle esigenze particolari Quindi ad esempio quando si introducono gli enzimi di restrizione si può ricordare che cosa fanno in natura servono ai batteri per difendersi dalle infezioni virali perché digeriscono cioè frammentano il dna dei virus ma non quello batterico che è protetto da dei gruppi chimici sulla sua sequenza ma quello che è interessante

per l'ingegnere genetico È che questi enz interrompono il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti su entrambi i filamenti del DNA in corrispondenza di una sequenza bersaglio quindi soltanto un certo ordine di nucleotidi per ciascun enzima di restrizione definisce la posizione in cui verrà interrotta la doppia elica Qual è il vantaggio Dato che quelle sequenze di riconoscimento sono delle palindromi se Voi leggete questa se da 5 primo a 3 primo è identica su entrambi i filamenti e la prima metà vedete è complementare alla seconda metà allora quando il taglio avviene non in mezzo ma all'estremità quello

che succede è che la molecola di DNA si spezza lasciando dei tratti a singolo filamento che sono tra di loro complementari possono riapparsi Allora se io tratto con lo stesso enzima di restrizione due molecole di Dna di origine completamente diversa vegetale batterica quello che ottengo sono dei pezzi di DNA che terminano con le stesse estremità che possono quindi appaiarsi Infatti si chiamano estremità coesive perché consentono di appiccicare di attaccare molecole di diena diverse che Sio state trattate con lo stesso enzima e quindi se io digerisco due molecole diverse con lo stesso enzima e poi le

le mescolo le loro estremità co compatibili si appaiano a questo punto il legame fosfodiesterico che era stato spezzato dall'enzima può essere ricostituito da un altro enzima la ligasi che è un enzima che è naturalmente presente in tutte le cellule perché serve proprio a replicare e a riparare il DNA Allora con questi due strumenti io posso creare delle molecole di DNA ibrido e quindi qui posso a questo punto definire Cos'è un DNA ricombinante quando io voglio trasferire un pezzo di DNA un gene da un organismo all'altro utilizzo come trasportatore una molecola di DNA doppia elica circolare

che si chiama plasmide e questi plasmidi sono degli elementi genetici presenti in tutti i batteri in natura sono quelli che portano ad esempio i geni per la resistenza agli antibiotici e che hanno la caratteristica di essere facilmente trasmissibili in via orizzontale quindi non da cellula madre a cellule figlie ma da tre individui della stessa popolazione Allora in laboratorio questi plasmidi sono stati modificati per diventare dei trasportatori di DNA e quello che di fatto lo studente deve ricordare sono le tre caratteristiche fondamentali che hanno questi vettori di clonaggio e cioè un'origine di replicazione cioè una sequenza

che consente a questa molecola di DNA di duplicarsi all'interno della cellula in maniera indipendente dal cromosoma cellulare e quindi quando un plasmide entra in un batterio se ne possono generare molte coopie all'interno della stessa cellula poi abbiamo un sito o una serie di siti unici di restrizione cosa voglio dire sequenze riconosciute da diversi enzimi di restrizione presenti solo in un'unica copia in questo modo quando io tratto questa molecola AV avò una sola interruzione un solo taglio dove poi potrò inserire il mio DNA esogeno e infine abbiamo un gene che dà la resistenza a un antibiotico

e che mi servirà per selezionare le cellule che hanno incorporato al plasmide Quindi quando io digerisco si dice questo vettore con un enzima di restrizione e poi con la ligasi ci saldo dentro un pezzo di DNA esogeno digerito con lo stesso enzima ottengo un DNA combinante che mi servirà per trasferire il mio Gene in un'altra cellula Allora Cosa vuol dire clonare clonare nella sua definizione fondamentale vuol dire ottenere molte coppie identiche ad esempio del gene che io vado a inserire in una popolazione batterica Come funziona il clonaggio abbiamo il nostro DNA ricombinante in cui Abbiamo

saldato il DNA esogeno questi vettori di clonaggio a questo punto vengono inseriti nelle cellule batteriche ci sono diverse tecniche quello che è importante ricordare che è un processo stocastico casuale Non tutti i batteri ricevono plasmide ed è qui che entra in gioco la resistenza agli antibiotici se io faccio crescere le cellule su un terreno con l'antibiotico solo quelle che hanno plasmide possono crescere perché resistono Allora se io semino queste cellule batteriche su questa piastra in con una diluizione tale per cui le singole cellule siano separate ciascuna cellula riproducendosi darà origine a una colonia di cellule

identiche ciascuna contenente lo stesso plasmide un clone e quindi clonare significa ottenere delle colonie geneticamente identiche ciascuna portante il plasmide di interesse ora da questo diciamo definizione operativa di clonaggio si può a questo punto aprire una finestra e dire Va bene E questa tecnica che cosa mi può servire ad esempio io posso crearmi una collezione di tutti i geni di un organismo posso prendere il genoma ad esempio di una pianta di un batterio di un uomo quello che volete lo posso fare a pezzi con degli enzimi di restrizione i vari pezzi li inserisco nel plasmide

ciascuno porterà un segmento diverso che conterrà un gene di trasformo cioè inserisco i plasmidi nei batteri li seleziono con l'antibiotico questa volta ogni Colonia rappresenterà un clone ciascuno dei quali conterrà uno dei tanti plasmidi che ho generato cioè uno ciascuno dei geni ad esempio di un organismo quindi ho di fatto una libreria genomica o genoteca da cui poi posso pescare il gene che mi interessa Allora come faccio a ritrovare Eh come in una biblioteca Come faccio a ritrovare il volume che mi interessa tra tutti quanti Un metodo che si usa molto è quello di utilizzare

la capacità di due filamenti di Dna di ibridarsi quando due filamenti singoli DNA hanno sequenze complementari tendono ad appaiarsi spontaneamente Allora io posso direttamente sulle colonie che sono cresciute ciascuna delle quali ha il miop plasmide denaturare quindi spisar denaturare il DNA in modo che sia singolo filamento e poi se sono in grado di generare un pezzettino di DNA singola elica che abbia la sequenza complementare a un tratto del Gene di mio interesse non a tutto basta solo un piccolo tratto e questo frammento che chiamo sonda viene marcato chimicamente i con della radioattività o con un

gruppo cheem luminescente o fluorescente Ecco che se io metto in contatto la sonda con il DNA presente all'interno delle cellule batteriche posso rilevare il segnale che mi identifica In quale clone questa sonda ha riconosciuto la sua sequenza complementare In altre parole posso pescare il volume che contiene il gene di interesse quindi in questo modo dalla mia genoteca posso ricavare quel plasm che ha quel pezzo di informazione che voglio allora Voi avrete visto avevate in mano i foglietti azzurri che tra i contenuti rinunciabile c'era anche la descrizione di alcune tecniche la PCR Com'è che possiamo collegare

la PCR a questo discorso Ebbene ad esempio ammettiamo di avere pescato il gene che io voglio studiare come faccio a studiarlo devo farme una grande quantità E allora ecco che la PCR mi serve per amplificare una sequenza di DNA che decido io in modo da averne a sufficienza per i diversi usi che ne farò il meccanismo n PCR di nuovo è spiegato benissimo nei libri Quindi non entriamo nei dettagli ma ricordiamo che di fatto quello che la PCR fa è riprodurre la reazione di replicazione del DNA utilizza una DNA Rasi noi gli diamo l'innesco che

si lega esattamente nella posizione che io poi voglio amplificare e la polimerasi fa il lavoro per me Qual è il trucco dato che la reazione Deve procedere denat e rinatura quindi bisogna scaldare e raffreddare dobbiamo usare degli enzimi cioè una DNA polimerasi che resiste al calore e che è stata purificata da dei batteri termoresistenti Allora la PCR serve a tante cose quindi di fatto ci può servire per pescare e amplificare un gene da una genoteca ma altro contenuto irrinunciabile che non ho che non ho sinceramente capito perché è considerato irrinunciabile Ma c'è nel programma è

una tecnica che si usa in diciamo biotecnologie forensi cioè il DNA fingerprinting la PCR ci consente esempio di generare l'impronta genetica di un individuo come perché ognuno di noi nel nel DNA ha dei piccoli tratti di sequenze corte da 3 A C nucleotidi che sono ripetute un certo numero di volte il numero di ripetizioni è diverso da individuo a individuo come le impronte digitali Allora se con la PCR io amplifico quindi genero tante copie a partire da un DNA genomico di un numero sufficiente di queste diverse ripetizioni di solito se se ne usano 13 quando

vado su un gel di agarosio a separare i frammenti ottengo delle dimensioni diverse che dipendono da quante coopie sono attaccate una all'altra e la combinazione di queste 13 è unica per Ciascun individuo la probabilità che due individui abbiano esattamente le stesse dimensioni di tutti e 13 Loci è di 1 per 10 all - 15 dato che nel mondo ci stanno 1 x 10 all - 9 o 7 x 10 all 9 Pardon persone ovviamente la probabilità è inferiore a quella che avere casualmente due persone in tutto il mondo che hanno questo stesso profilo e quindi

la PCR ci può servire per fare il DNA fingerprinting un'altra applicazione della PCR oggi è quella che consente di leggere l'informazione genetica Allora la sequenza del DNA è l'ordine in cui si susseguono i nucleotidi questo ordine determina il contenuto informazionale in base all'ordine dei nucleotidi e sapete abbiamo le triplette che specificano l'aminoacido che andrà a comporre una certa proteina Allora leggere l'ordine dei nucleotidi significa decodificare l'informazione che c'è all'interno del DNA oggi la lettura del DNA avviene con i sequenziatore automati che di nuovo sfruttano la reazione di PCR Io prendo il frammento di DNA di

cui voglio conoscere la sequenza ne faccio tante copie con una reazione di PCR ma utilizzo come mattoni dei nucleotidi trifosfato che hanno un gruppo chimico fluorescente che ha un colore diverso per ogni nucleotide Allora nella macchina man mano che la polimerasi genera l'elica complementare a quella di sequenze ignot un raggio laser illuminando la reazione Identifica il colore e mi dice in tempo reale quale nucleotide è stato attaccato e quindi il computer decodificando i colori mi dà la sequenza del mio frammento ora questa reazione oggi è estremamente miniaturizzata per cui noi possiamo fondamentalmente con i nuovi

sequenziatore automatici arrivare a leggere quasi un miliardo di nucleotidi per ogni ciclo di reazione e quindi in circa due settimane possiamo sequenziare completamente il che vuol dire leggere almeno cin volte il genoma umano e il costo di un sequenziamento genomico umano oggi è intorno ai €1000 Tra l'altro la tecnologia è così miniaturizzata che ci sono sequenziatore automatici di questo tipo grossi Quasi come Eh beh lo vedete qui Esatto come il mouse di un computer questo è un astronauta sulla stazione spaziale europea che sta sequenziato del DNA batterico per dimostrare la portatilità di questi strumenti che

oggi vengono usati in campo per sequenziare direttamente l'informazione genetica ad esempio di tutti i microorganismi presenti in un campione di suolo Allora le tecniche che cosa ci possono dire e quali possono essere a questo punto le prime applicazioni di tutta questa tecnologia Ad esempio la possibilità di sequenziare interi genomi ha aperto l'era della genomica quell'insieme di come dire discipline che studiano nel complesso tutti i geni di un organismo e ci sono due tipi di genomica quella che Paragona i genomi di organismi diversi per stabilirne le relazioni evolutive o per capire quali sono i geni conservati

e quindi importanti essenziali per la vita e la genomica funzionale che in maniera sistematica vuole sapere ogni gene che funzione ha allora ad esempio per la genomica comparata se vogliamo come dire Magari incuriosire lo studente senza entrare in grossi studi diciamo di filogenesi quando abbiamo paragonato il genoma diciamo umano a quello degli altti organismi abbiamo scoperto che circa il 40% del nostro DNA è di origine virale sono sequenze di DNA mutuate da virus retrovirus che durante l'evoluzione Quindi anche milioni di anni fa sono entrati nella nostra linea Germinale e sono rimasti e alcune di queste

informazioni sono ancora usate sono molto importanti La placenta dei placentati ha come componente fondamentale una proteina che si chiama sincitina che è una proteina di un retrovirus che circa 50 milioni di anni fa è entrato nella linea evolutiva che poi avrebbe dato origine ai placentati così come i mitocondri che erano dei batteri hanno ancora dentro un po' di DNA che è di Chiara origine batterica di fatto la genomica comparata ci ha rivelato che il trasferimento di geni tra specie diverse non è un evento raro e neanche artificiale ma è il modo con cui l'evoluzione va

avanti perché tutte le specie viventi Tra l'altro specie è una definizione Oper non esistono diciamo delle barriere specifiche sono fatte da come dire composizioni di materiale genetico di origine molto diversa Come facciamo a introdurre o a dare un esempio di come si studia la funzione dei geni genomica funzionale Allora una cosa di cui si sente spesso parlare sono questi famosi micro errei di fatto la possibilità di identificare esatt quali geni sono espressi in una certa cellula in un certo momento allora il concetto da recuperare è tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso DNA

ma lo usano in maniera differenziale i neuroni e cellule muscolari usano diverse batterie di geni Come faccio a vedere quali geni sono utilizzati uso queste lastrine che hanno circa 1 cm e me di lato su cui sono posizionati in maniera ordinata e nota ad esempio tutti i 20.000 geni umani sotto forma di corti oligonucleotidi Allora io posso estrarre da una popolazione cellulare gli RNA Messaggeri che identificano quali geni sono espressi e solo quelli li posso convertire in DNA e poi rendendoli a singola elica e marcandola fluorescenti li posso fare diciamo così mettere in presenza di

queste micropiastre e laddove il mio R Messaggero troverà la sequenza complementare si legherà e mi darà un segnale fluorescente usando due colori diversi posso confrontare due popolazioni diverse verde è acceso qui rosso è acceso qui giallo è presente in tutte e due e dato che la macchina riesce a leggere quanto questo giallo è più vicino al verde o al Rosso mi dice anche la differenza di espressione applicazione pratica posso confrontare una C normale una cellula tumorale e vedere quali sono i geni importanti per lo sviluppo tumorale ricaduta sulla salute umana oggi ad esempio le terapie

con gli anticorpi monoclonali per il tumore al polmone o il tumore al seno sono offerte solo se le cellule tumorali esprimono una particolare proteina viceversa non vengono date perché sarebbero inutili Ovvero la decodificazione e della espressione genica oggi viene utilizzata per guidare la terapia e si chiama medicina personalizzata altro esempio di genomica funzionale può essere l'inattivazione dei geni posso decidere di capire cosa fa un gene se lo spengo il problema è che se voglio capire che cosa fa un gene a livello di un organismo devo generare un organismo mancante di quel Gene Sono i famosi

topolini knockout quello che si fa utilizzando un vettore che porti una versione difettiva del mio Gene io posso inserire questo vettore nelle cellule dell'embrione un meccanismo naturale che è la ricombinazione omologa scambierà il gene Non funzionale con quello endogeno e avrò quindi un embrione in cui le cellule mancano di un gene da cui poi si svilupperà un organismo un topolino in questo caso mancante di quel Gene i topi knockout Oggi sono il modello di elezione per molti tumori e per molte malattie metaboliche Anche perché non possiamo ovviamente generare degli uomini knockout e quindi dobbiamo rifarci

dei modelli animali la eliminazione di un gene è solo una delle tante possibilità offerte dalle biotecnologie in realtà quello che le biotecnologie fanno molto di più è aggiungere geni Allora recuperando la tecnica del clonaggio e quindi la possibilità di trasferire un gene da una cellula all'altra Ecco che otteniamo la possibilità di inserire un vettore ad esempio che abbia un gene in una cellula che questo Gene non possedeva E questa volta il vettore è fatto in modo che questo Gene venga espresso si chiama vettore di espressione e quindi la cellula che incorpora il plasmide produrrà una

proteina che prima non produceva e è diventato un organismo geneticamente modificato in particolare Un bioreattore Allora questi sono degli esempi di proteine di interesse farmacologico l'insulina umana per i diabetici molti fattori per curare l'emofilia che oggi sono prodotti in microrganismi metodo molto più sicuro e molto più facile che purificarlo ad esempio dagli organi degli animali morti come si faceva una volta con l'insulina non solo Possiamo aggiungere dei geni possiamo o togliere li possiamo anche ridisegnare Cioè oggi ci sono delle tecniche che fondamentalmente usano chiamiamoli un'evoluzione degli enzimi di restrizione cioè de dei sistemi che consentono

di introdurre delle interruzioni quindi delle Rotture nel DNA in qualsiasi posizione decisa dallo sperimentatore non non è più quindi necessario che cercare un DNA che abbia un sito di restrizione lo decido io e ci sono diverse tecniche sono tutte basate su degli elementi proteici oppure un RNA che si legano a una sequenza specifica che io posso determinare sintetizzando Comi queste proteine o questo RNA in laboratorio accoppiati a delle nucleasi cioè degli enzimi che tagliano di DNA quindi l'elemento di riconoscimento guida la nucleasi dove voglio io la nucleasi taglia allora in questo modo io posso inserire

aggiungere o inattivare Geni in qualsiasi posizione del genoma e questo ovviamente ha aperto la strada a una serie di applicazioni molto interessanti Questo esempio che vi faccio sono due scimmiette che sono state generate l'anno scorso con questa tecnologia Come modelli per una patologia del sistema immunitario per cui non umano per cui non esisteva nessun modello animale andando a ingegnerizzare esattamente quel Locus Ok allora come dicevo ci sono tantissimi possibili esempi di applicazione in diversi campi quindi adesso io vorrei darvi molto rapidamente Alcune Alcune suggestioni alcuni suggerimenti sottolineando il fatto che poi ognuno di voi sulla

base delle proprie esigenze potrà decidere se o meno diciamo approfondire questi argomenti Allora quando si parla di aggiunta di geni lo si può fare non soltanto per produrre delle proteine quindi per avere i bioreattori Ma possiamo anche dotare gli organismi di caratteristiche utili per un impiego ad esempio la bonifica delle acque allora un inquinante molto pericoloso è il mercurio che è difficile da eliminare per via chimic fisica sono stati generati dei batteri in cui inserendo dei geni di lievito per un canale che è in grado di importare il mercurio e per una proteina che è

in grado di catturare e concentrare il mercurio all'interno della cellula batterica si sono generati dei biofiltri matrici batteriche Su un supporto solido che di fatto sono delle spugne che assorbono il mercurio e quindi sono in grado di purificare dell acqua e esistono biofiltri oggi per molti inquinanti soprattutto metalli pesanti dato che noi possiamo trasferire geni possiamo anche trasferire interi circuiti metabolici addirittura facendone di nuovi allora ad esempio sono stati fatti dei batteri che sono in grado di utilizzare come fonte di energia la caffeina e questo grazie al montaggio di cinque geni provenienti da due specie

batteriche diverse in modo da creare una via metabolica che non esisteva in natura il motivo per cui è stato fatto questo lavoro è che uno dei prodotti finali della via metabolica la xantina metilata è un profarmaco è un principio attivo ad esempio di farmaci contro l'asma o di sciroppi per la tosse o di broncodilatatori ora questa xantina metilata per via Chimica è molto difficile da sintetizzare Ma questi batteri come bioreattori la sintetizzano dalla caffeina che è un precursore a basso costo e diciamo che oggi sono stati generati come dire nuove vie metaboliche per produrre tantissime

molecole di interesse sia farmacologico che industriale possiamo trasferire geni ovviamente anche negli organismi superiori ad esempio le piante il meccanismo con cui si trasformano le piante principalmente è basato su un batterio si chiama agrobacterium che in natura causa tumori alle piante come fa a causare i tumori ha un plasmide che quando il batterio infetta la la pianta si trasferisce e integra i suoi geni nel cromosoma della cellula vegetale quindi di fatto questo batterio è un ingegnere genetico naturale i geni del batterio nel cromosoma producono delle sostanze di cui il batterio si nutre per cui lui

fa un OGM a scopo alimentare per capirci Allora è stato come dire modificato in modo da non renderlo più patogeno e questo plasmide è diventato un vettore noi inseriamo il gene di interesse nel plasmide mettiamo il plasmide nel batterio il batterio ce lo trasferisce nel cromosoma della cellula vegetale se noi questo gioco lo facciamo con questo particolare materiale i calli vegetali che non sono nient'altro che dei pezzi di tessuto adulto foglia coltiva su degli ormoni vegetali In modo tale che la cellula adulta regrediscono fare ogni callo che deriva da un pezzo di foglia può generare

una pianta intera ed ecco quindi che noi possiamo avere dei cloni perché avranno tutti Il DNA della foglia transgenici se ci inseriamo dentro un gene evoluto allora con queste tecniche ad esempio è stato fatto il famoso mais che resiste alla attacco della larva piralide perché esprime un pezzo di un gene di un batterio del suolo che è a sua volta una tossina selettiva per questi insetti e quindi questo mais non necessita più dei pesticidi ad esempio tra l'altro questo mais rappresenta il 70% del mais utilizzato per i mangimi animali nel mondo e in Italia ne

compriamo qualche milione di tonnellate all'anno perché non lo possiamo coltivare Queste sono un po' le bizzarrie italiane possiamo arricchire da un punto di vista nutrizionale delle piante per uso alimentare il riso che produce che accumula betacarotene cioè vitamina A Grazie all'introduzione di geni del Narciso del mais e di un batterio del del suolo è il famoso Golden Rise che si sta sperimentando Per supplire alle carenze vitaminiche di certe aree del mondo come l'Asia o l'Africa e diventa giallo perché è ricco di betacarotene chiaramente possiamo fare questi trucchi questi giochi anche con gli animali possiamo cioè

generare delle pecore delle mucche delle capre transgeniche che producano dei prodotti di interesse ad esempio farmacologico siano esse stesse dei bioreattori ma lo possiamo fare in maniera tale che questi elementi vengano secreti nel latte quindi dal latte di queste di questi animali transgenici possiamo purificare insulina antinfiammatori anticoagulanti o avere dei latti arricchiti nutrizionalmente possiamo ovviamente clonare gli animali allora qual è la differenza tra clonaggio e clonazione clonaggio tante coppie di un frammento di DNA clonazione tanti organismi geneticamente identici la famosa pecora Dolly Eh è il stato il primo CL ottenuto prendendo il nucleo di una

cellula adulta e mettendolo dentro un ovocita di pecora cui era stato tolto il suo nucleo e si è generato un embrione diciamolo così artificiale perché è stato importante imparare a clonare gli animali cosa ci ha insegnato ci ha insegnato che il DNA che viene da una cellula adulta cellula animale adulta può ritornare a funzionare come il DNA di una cellula embrionale In altre parole se io prendo un nucleo di di una cellula epiteliale e lo metto in un ocita ottengo non tante cellule epiteliali ma un embrione che mi darà un organismo intero Quindi è possibile

riprogrammare un DNA che ha molti anni ed è specializzato a fare una certa cosa per farlo tornare indietro nel tempo e questo ha diciamo così suggerito la soluzione a un problema che era quello del l'uso delle cellule staminali le cellule staminali per definizione sono quelle embrionali Cioè le prime cellule dell'embrione Toti potenti possono differenziarsi in tutti i tipi cellulari meraviglioso noi in laboratorio possiamo dalle cellule embrionali staminali differenziare diversi tessuti che poi possiamo reimpiantare per curare gli infartuati diabetici eccetera Sulla carta Il problema è che abbiamo bisogno di embrioni umani e quindi dobbiamo generare gli

embrioni e distruggerli e questo è eticamente sensibile ci sono delle cellule staminali adulte come quelle che rigenerano le cellule del sangue le staminali ematopoietiche che oggi vengono usate nei trapianti per curare le leucemie ma sono poche sono multipotenti cioè possono differenziarsi in pochi tipi cellulari sono difficili da isolare rifacendosi al concetto che è possibile riprogrammare un DNA adulto questo signore Shin yamanaka che ha vinto il premio Nobel qualche anno fa ha trovato il modo di rendere staminale una cellula adulta inserendo quattro Geni in qualsiasi cellula che riprogrammano il DNA in maniera tale che quella cellula

adulta diventi una cellula staminale si chiama pluripotente indotta allora cosa ci può aiutare a fare questa tecnologia pensiamo alla terapia genica la terapia genica è inserire un gene laddove manca ad esempio una bambina è stata curata a metà degli anni 90 per la deficienza da un enzima l'adenosina di aminas che le impediva di avere un sistema immunitario normale si usano di solito dei virus modificati che un po' come fa agrobacterium inseriscono il gene di nel cromosoma della cellula umana il problema è che è difficile inserire il gene Al posto giusto nel momento giusto e soprattutto

non tutte le patologie possono essere curate ex vivo cioè prendendo i linfociti ingegnerizzare reintroducendo la terapia genica accoppiata alle cellule staminali può risolvere molti problemi ad esempio io ho un paziente che ha un difetto genetico nel fegato prendo le sue cellule del fegato difettose le rendo staminali pluripotenti correggo Il difetto genetico differenzio queste cellule curate di nuovo in epatociti le rimpianto nel fegato e questi ricominceranno a produrre la proteina mancante oggi ci sono dei Trial clinici che con questa tecnica fanno esprimere i fattori della coagulazione nel fegato degli emofiliaci ultimissima cos se vogliamo uscire un

flash dall'ambito biomedico con le biotecnologie è possibile anche generare energia in maniera alternativa ad esempio è possibile migliorare la capacità di certi batteri di fermentare quindi di ossidare delle molecole presenti ad esempio negli scarti vegetali o nell'acqua della fonia l'ossidazione crea un flusso di elettroni che se viene intrappolato tra due poli da una corrente elettrica e quindi ci sono delle pile con dei batteri super fermentatori che danno energia elettrica dall'acqua della fogna quindi siamo al di là dell'energia pulita e che cominciano anche a diventare commercialmente interessanti Allora quali sono le cose che non posso non

dire insegnando le biotecnologie una definizione corretta gli strumenti e le tecniche di base dell' ingegneria genetica in particolare il clonaggio qualche esempio di applicazione da quelle di base farmi la libreria andare a pescare il gene che voglio amplificarlo sequenziali studi più raffinati di genomica comparata e funzionale almeno dire che cosa sono e a questo punto Poi chiaramente in base alla disponibilità del tempo le applicazioni il mio suggerimento è quando noi trattiamo uno strumento e una tecnica di base possiamo subito regli un'applicazione e in questo modo si crea un filo conduttore che consente al ragazzo di

ritenere meglio i concetti e con questo vi ringrazio per la pazienza