CRISTALOGRAFIA DE RAIO X DE MOLÉCULAS

Olá meninos como é que vocês estão Espero que estejam bem e primeiramente eu queria pedir desculpas a vocês né porque eu demorei demais para entregar o o material Mas foi porque eu tava com muita demanda E aí era uma função em cima de outra função que acabou tomando todo o meu tempo eu acabei não entregando material para vocês a tempo mas quando eu perguntei a Cecília a Cecília me disse Que ainda tinha um tempo disponível para poder enviar a as atividades então eu resolvi encaminhar para vocês a aula eu peço a vocês que façam uma

resenha em trio dessa aula e coloquem lá no ava e aqueles alunos que ainda não estão cadastrados no ava que por favor por favor façam com aqueles que já estão cadastrados porque aí facilita a o a acessibilidade de vocês tá certo e hoje a gente vai trabalhar um pouquinho falar um pouquinho de cristalografia de Macromoléculas né a Biologia sobre a ótica dos raios X Tá bom a gente vai falar de cristalografia de raio x porque ela é uma técnica né que do ponto de de vista né Ela é uma técnica que a gente utiliza na

verdade para que a gente possa estudar as proteínas né a função e a forma dessas proteínas elas vão estar intimamente ligadas então a compreensão de uma estrutura tridimensional por exemplo de uma proteína ela vai ser importante para que A gente possa elucidar de forma bastante alhada os processos biológicos Nos quais elas participam Tá certo então cristalografia ela vai ser uma uma poderosa técnica que é empregada para que nós possamos determinar e a a estrutura né da da das proteínas em geral por isso a gente quando a gente pensa em em proteínas né a gente pensa

e entende que proteínas elas vão ser macromoléculas Tá certo macromoléculas Biológicas que na verdade vão constituir um maquinário metabólico e que vai ser responsável pela manutenção da vida então a gente vai ter inúmeras funções cumpridas por essas moléculas que vão desde as mais simples como por exemplo a composição de estruturas celulares até Aquelas que nós consideramos mais complexas como complexas como por exemplo a produção eh de de proteínas no ribosom então quando a gente fala de proteína ela vai Apresentar quatro aspectos né o o as proteínas que vão ter a estrutura é primária né aquelas

que vão ter a estrutura secundária a terciária e a quarta ternária tá bom a estrutura primária ela vai ser constituída e caracterizada por uma sequência linear de aminoácidos você pode ver aqui que se a gente tem por exemplo a pralina alamina o ácido [Música] peptídicas Então essa estrutura primária Aqui é uma configuração simples porém nem não menos importante porque vai ser dela que vai se derivar todo o arranjo espacial dessa molécula Então a partir dela a gente tem a estrutura secundária essa estrutura secundária ela é caracterizada pelo estabelecimento de ligações de hidrogênio que vai acontecer

entre um aminoácido de uma cadeia proteica os elementos desse tipo de estrutura mais comun são as proteínas Alf hélice mas também a gente vai ter a Presença das Folhas betas pregueadas e a gente tem também a estrutura terciária que essa aqui que tem um formato global é constituído por uma única cadeia polipeptídica e seu arranjo é um arranjo meio que tridimensional então é esse arranjo tridimensional que vai ser importante para que a proteína ela realize os diversos tipos de funções o principal fator aqui que determina essa estrutura como a estrutura terciária é porque essa Proteína

ela tem um efeito hidrofóbico ou seja as suas cadeias laterais né Eh eh desses aminoácidos eles acabam sendo não polares e por eles terem essa característica eles acabam ficando escondidos dentro da estrutura enquanto que aquelas cadeias laterais dos resíduos polares ficam expostos à superfície e acabam interagindo com o meio né e isso faz com que você tenha as interações aí acontecendo eh esse tipo de ligação é um Tipo que você vai ter ligaç de hidrogênio que também é predomina né porque você tem essa tipo de ligação na na na na estrutura secundária e geralmente quando

a gente fala do dessa estrutura do tipo terciária é uma estrutura que a gente chama ela de de uma proteína do tipo enovelada e a gente vai ter por fim a estrutura Quarter nária né ela vai ser caracterizada pela associação de duas ou mais as Polipeptídicas geralmente essas estruturas são estruturas que apresentam várias subunidades e que Vai resultar no final num idade ativa esse tipo de estrutura acaba sendo eh estabilizada não somente por ligações de hidrogênio mas também por ligações de vanderval por ligações iônicas por [Música] eh interações hidrofóbicas que vão prevalecer ali também e

essa estrutura Quar ternária é é uma estrutura que vai estar intimamente ligada à sua função né E por ela estar intimamente ligada à sua função ela acaba nos ajudando a elucidar vários processos biológicos que são fundamentais então muitas das vezes quando a gente quer determinar a estrutura de uma molécula é pra gente poder usar no diagnóstico de uma doença ou no num fármaco que possa ser desenvolvido para aquela doença para um determinado tratamento específico Então Essa forma Quarter Ná é uma forma que que a gente acaba Estudando muito porque a gente consegue ver as interações

em sítios específicos da dessa proteína com moléculas né pequenas moléculas que são chamadas de ligantes isso vai proporcionar aí um um estudo eh da da estrutura e da função dessas proteínas então é fantástico quando a gente começa a trabalhar com as estruturas dessas proteínas e começa a entender né o todo né a gente começa por Exemplo o diagnóstico do S cov2 recentemente a gente se deu através da estrutura cristalografica dessas proteínas então é importante que nós tenhamos isso pra gente poder entender o que é a cristalografia de Raio X E como é que ela pode

ser aplicada a diversas moléculas bem existem três maneiras da gente obter informações que são detalhadas sobre a resolução atômica né Então essas eh essas três maneiras elas vão nos ajudar a a entender eh as Estruturas da essas proteínas que são a cristalografia né a ressonância magnética nuclear e mais recentemente a técnica de cria microscopia eletrônica certo e o que o que o que tem em comum e de diferente entre essas três técnicas a nível de resolução essa a tanto a a enquanto que a cristalografia em geral ela vai nos permitir uma maior resolução e a

determinação de estruturas maiores a ressonância magnética nuclear ela vai nos for além dessas informações detalhes Sobre os processos dinâmicos que vão estar relacionados obviamente com ao intercâmbio da da da conformação daquela solução daquelas moléculas que ali estão e algumas delas elas podem ser de forma essas informações elas podem ser de forma transitórias eh e resistentes à cristalização enquanto que cria microscopia eletrônica ela vai nos permitir estudar as proteínas os seus complexos macromoleculares aí você já estuda ela e Porque E aí você já tem um detalhe importante aí que é o tamanho e a flexibilidade intríseca

dessas moléculas e por isso elas não podem ser estudadas por cristalografia nem tampouco por rea magnética nuclear e por isso a gente utiliza a técnica de cria microscopia eletrônica que aí facilita a identificação e a resolução dessas dessas dessas moléculas atômicas aí presentees nessas proteínas bem e por que que essa técnica De cristalografia molecular ela de molecular e de raio x ela é importante né porque ela é uma técnica que ela vai nos ajudar né a a a a visualizar estruturas dimensionais dessas proteínas em resolução atômica então é um método na verdade que vai nos

fornecer informações valiosas sobre a noa maquinaria da vida né que necessariamente são as proteínas né as proteínas na verdade elas são chamadas como calos de batalha da célula e vão Desempenhar como eu falei para vocês nos slides anteriores infinitas funções que vão desde a catalisação de reações bioquímicas passando eh na na na função de suporte estrutural até a gente poder compreender por exemplo Qual é a estrutura crucial que possa compreender a função e o desenvolvimento de novos medicamentos e terapias que possam ser utilizado na na cura de doenças ou no tratamento de diversas manifestações patológicas

Então quando a gente tem essa técnica ela ela possui essa essa capacidade que a gente que que ela nos fornece que é na verdade de a gente poder visualizar essas proteínas e uma resolução atômica e isso teve um impacto transformador porque acabou eh fazendo com que nós pudéssemos descobrir nossos novos designs por exemplo de medicamentos que são importantes né eh e e e e e acabou que a partir desse conhecimento que é o conhecimento dado Com uma forma um pouco mais precisa né em um ambiente químico onde você vai ter um sítio ativo de uma

proteína eh interagindo e se ligando ali aos receptores que são importantes para poder evocar um mecanismo Então as empresas farmacêuticas elas acabam projetando essas moléculas vendo como essas moléculas acabam se interagindo especificamente com aquela proteína para poder ativar ou inibir uma determinada função então isso só é possível porque Tudo começa quando você trabalha com a cristalografia então a cristalografia ela acaba sendo uma abordagem meio que irracional porque ela ajuda nessa concepção de medicamentos leva a desenvolvimento de diversos medicamentos dentro da da do ramo farmacêutico mas eh que inclui diversos tipos de de moléculas né a

gente ve viu recentemente os inibidores de proteases por exemplo eh do SAS cov 2 e existe algumas terapias específicas por exemplo Contra o câncer eh que a gente vai utilizar e tudo isso faz parte da física molecular e a cristalografia ela tá aí para isso para nos ajudar a entender porque que que como que essas moléculas elas funcionam estruturalmente como que a gente pode manipular Essas funções essas proteínas aí então a técnica em si da cristalografia de ra x ela é uma técnica que consiste a gente ter um cristal por esse Cristal a gente tem

um feixe de raio x né na forma de radiação Eletromagnética a gente vai discutir isso nos slides seguintes né a gente vai trabalhar um pouquinho mais sobre isso nos slide tentar entender um pouquinho e através de um cristal que é esse Cristal aqui né a a substância ela acaba sendo sujeita a um um determinado estudo então a gente tem um feixe esse feixe então ele se difunde tá e quando ele se difunde a gente vai ter aí várias direções devido a simetria do agrupamento daqueles átomos e pela Difração não dando origem assim a um padrão

de intensidade né que vai ser interpretado esse esse padrão de intensidade é interpretado a partir de uma lei chamada Lady Black né E com isso a gente pode extrair numerosas informações sobre a estrutura atômica daquela molécula que tá sendo demonstrada ali então a gente vê que o raio X é é importante a gente vê que a formação do Cristal é importante o princípio de difração também é Importante então a gente vai estudar cada um desses elementos e quando tentar com entender Por que eles são importantes e aí a gente começa a trabalhar um pouquinho com

a parte do Da Da Da Da cristalização né Porque é ela vai ser realmente a etapa mais complexa quando a gente quer determinar uma estrutura de uma macromolécula e pra formação de um monocristal que a gente tenha na verdade um tamanho uma qualidade adequada Para que ocorra ess Experimentos ele vai depender de vários parâmetros então eu posso dizer que a cristalografia de Raio X Ele vai ser um processo onde a gente vai envolver várias etapas né E E essas etapas são as etapas que são denominadas etapas de purificação de proteínas etapas de cristalização a etapa

de determinação da estrutura e aí por último a gente tem a etapa de refinamento na etapa de cristalização a proteína de interesso ela deve ser isolada purificada né de Out isolada e purificada dos os outros elementos celulares é muito semelhante ao que acontece a purificação no caso a o que a gente pode utilizar a cromatografia por exemplo para poder isolar aquela molécula Ou a gente pode uar um espectrofotômetro de massa que a gente vai ver quais são as substâncias que ali estão Mas o importante é que a gente isole essa molécula ela seja purificada para

que a gente tenha um um o valor quanto mais fidedigno possível Aí a gente passa pro processo de cristalização nesse processo de cristalização a proteína ela purificar ela é induzida a formar um cristal né a a partir de um um conjunto que vai ser altamente ordenado de de moléculas E aí a partir desse conjunto ordenado de moléculas a gente tem um processo necessariamente de cristalização não é um processo fácil eh que se vocês forem procurar na literatura você vê que eh muitas das vezes a gente não consegue Formar o monocristal mas eu vou passar para

vocês algumas dicas que vão ser importantes nesse processo a a a a a a gente tem a coleção dos dados nessa coleção dos dados os raios X eles são direcionados ao Cristal e o padrão dos raios difratados ele vai ser registrado e depois a gente passa por um um outro processo que é o processo chamado de determinação da estrutura no qual o padrão de difração ele vai ser analisado eh usando alguns algorítmicos Matemáticos para construir um modelo de estrutura atômica dessa proteína e por fim a gente tem o que nós chamamos de refinamento onde você

tem um modelo Inicial e esse modelo ele é refinado Para poder melhorar os ajustes aos dados experimentais e isso Vai resultar em uma estrutura tridimensional detalhada que é a estrutura que nos interessa bem Eu gostaria de ressaltar para vocês que cada uma dessas etapas que foram apresentadas aqui elas são Importantes porque você precisa ter um cuidado conhecimento meticuloso pois a qualidade dessa estrutura final ela vai ser altamente dependente da qualidade dos Cristais e dos dados coletados né E apesar de de de do do poder que tem a cristalografia de rax ela apresenta alguns desafios esses

desafios precisam ser ditos para que a gente possa cada vez mais melhorar a técnica e que precise ter um produto final de qualidade então por exemplo quando você Vai purificar eh as proteínas você precisa saber qual tipo de purificação que você vai utilizar né que melhor Vai representar como eu falei para vocês no anterior eh a composição e o PH daquela da daquela proteína para ser purificada precisa ser levado em conta também porque quem trabalha com cromatografia sabe que isso é de importante valor porque para cada local a que a proteína está atuando ela tem

um PH específico então é preciso ter esse cuidado na hora Que você for trabalhar com o processo de cristalização a concentração Salina a gente vai conversar disso daqui a pouquinho também vai ser importante dentro desse contexto de temperatura do ambiente também então você precisa ter um ambiente bastante refrigerado Para que ocorra todo o processo e todo o controle disso então Toda vez que você for trabalhar com cristalografia você precisa verificar todos esses parâmetros para que seu seu trabalho não seja em Vão Então é inquestionável a a a importância que tem a cristalografia nas nossas vidas

no no sentido de que ela é importante pra gente poder realmente detectar as estruturas né as proteínas de de uma forma na sua forma estrutural e e a a importância que ela tem quando a gente fala de dos aspectos biológicos Mas apesar desse poder né resolutivo que tem o exame de cristalografia ele apresenta obviamente como qualquer outra técnica seus Desafios uma delas é a obtenção do Cristal de alta qualidade né porque costuma ser um grande gargalo a gente poder obter esses cristais porque nem todas as proteínas elas vão se cristalizar imediatamente Além disso Assim como

as outras técnicas Por exemplo quando eu fui fazer a espectrometria de massa eu precisei de uma concentração bastante significativa de proteínas e nesse caso pra cristalografia também não vai ser Diferente a gente vai precisar ter uma grande quantidade de proteína porque é a partir dela que a gente pode ter eh uma boa resolução porque se a gente não tiver uma quantidade tão boa boa o suficiente pra gente poder fazer a cristalografia vai ser difícil se a gente produzir certos tipos de cristais Tá certo outra questão que é importante aí que precisa ser Dita é que

aspectos dinâmicos dessa proteína como por exemplo as mudanças conformacionais e a Flexibilidade também podem ser difíceis de capturar com estruturas cristalinas estáticas então eh São coisas que infelizmente a gente precisa ter em mente antes de a gente começar a trabalhar com cristalografia para que a gente não vá comece a iniciar vá pro laboratório específico que não tem esses parâmetros bem predeterminados a primeira fase né paraa formação de um cristal é o que nós chamamos de crescimento né então o Crescimento de do de um cristal de uma proteína ela vai começar a partir de uma solução

que nós chamamos de uma solução super saturada da macromolécula essa solução ela evolui termodinamicamente né de forma estável eh nesse caso aí essa proteína ela vai ser fracionada entre duas fases né a fase sólida e a fase que nós chamamos de solução você vai ter aí um tempo necessário para que ocorra um equilíbrio e que esse equilíbrio ele seja atingido até a grande influência Sobre o resultado final isso pode ir de um simples precipitado a mofa até um microcristalino podendo ultrapassar para grandes monocristais que é o que vai nos interessar Tá certo eh a gente

ainda tem eh a precipitação da da da proteína que é importante né ela entra em um estado de supersaturação isso se dá por condições do Meio como por exemplo a concentração da da proteína a concentração do agente precipitante que vai ser importante Também eh a temperatura né as forças iônicas que regem aquela solução aquelas interações que estão ocorrendo ali o o o o PH como eu falei para vocês entre outras eh elementos que podem ser importante pro processo de de crescimento desse Cristal como tudo tá certo a cristalização ela começa com uma fase chamada de

nucleação né Ela é conhecida como a fase de formação dos primeiros agregados ordenados e ela acontece logo após Aquela fase que a Gente denominou anteriormente que é a fase de crescimento então Para que ocorra a nucleação a gente vai requerer de um estado de supersaturação maior do que aquela que foi requerida para de crescimento Tá certo E se nós considerarmos que uma proteína é quando ela está dissolvida em um em um tampão por exemplo Nessa situação a para que uma proteína ela seja levada a formar cristais é necessário que essas moléculas proteicas sejam dissolvidas em

Uma determinada solução e que elas sejam trazidas a uma situação onde essas moléculas elas estejam bem próximas umas das outras o que nós podemos podemos fazer para que para levar essa proteína a essa situação é que nós podemos por exemplo aumentar a concentração dela tá certo se a gente aumenta a concentração dessa proteína ou se por exemplo a gente aumentar a concentração do sal que tá presente naquela solução onde aquela proteína ela Está mergulhada a gente pode trazê-la uma reg a uma a uma e região de su saturação de uma forma lenta né Isso vai

fazer com que por exemplo nessa região de supersaturação a gente tenha molécula de proteínas que estejam próximas umas à outras e que nesse caso né que que ela por elas estarem eh como é que se diz eh próximas umas à outras elas são mais favoráveis ao aparecimento dos primeiros cristais né dos primeiros eh amorfos cristalinos que podem estar eh sendo Formadas ali naquela solução E aí quando a gente pensa nesses microcristais propriamente dito cristais eles vão servir né de base para o crescimento dos Cristais maiores Então são exatamente esses cristais maiores que vão nos interessar

Porque a partir deles que nós vamos ter eh os os cristais com tamanho ideal para que nós possamos realizar a cristalografia de rax então pra gente poder entender esse Fenômeno de nucleação a gente precisa primeiro eh entender como é que ocorre essa solubilidade dessa macromolécula bioló lógica então a gente pode ter solubilidades abaixo e acima de 5 molar né Eh mol E aí a de cinco não de 0,5 mol Tá certo e abaixo de 0,5 mol a gente chama esse fenômeno de salte Tá certo e esse fenômeno ele vai ser explicado pelas interações eletrostáticas que

não não específicas que ocorrem entre moléculas carregadas né e a espécie Única nesse caso do sal aí a teoria de Deb huckle que é uma teoria que vai nos dizer que que para as soluções iônicas a gente vai ter por exemplo um aumento né Eh da força iônica E que esse aumento reduz a atividade eh desses iOS em uma determinada solução isso faz com que a gente tenha um aumento da solubilidade desse composto iônico Tá certo isso desculpa uma forma alternativa que a gente pode utilizar paraa gente poder tratar este Fenômeno é considerar o salte

como resultado de competição entre os grupos carregados na superfície da macromolécula e os iOS em solução então na ausência de um ion eh no solvente Essa macromolécula ela precipita devido à tração eletrostática entre as cargas Opostas em diferentes partes da macromolécula E se esses zinhos eles são adicionados a uma solução eles brindam os os grupos carregados na macromoléculas e acabam aumentando assim A solubilidade o princípio é meio que parecido com o princípio de blindagem que ocorre no fenômeno de ressonância magnética nuclear só que nesse caso aqui a gente tá tratando do processo de formação de

cristalização grosseiramente falando é um processo meio que parecido mas não iguais tá certo processo de blindagem que ocorre esses grupos né de de compostos e a [Música] e outra forma de precipitar a Macromolécula é pelo fenômeno eh que onde a gente vai adicionar sal que a gente chama de sal out né o o sal ele vai servir para imobilizar essa molécula eh e nesse caso aí em específico ele vai servir para imobilizar moléculas de água e dessa forma ele consegue aumentar a concentração efetiva da maca molécula proteica diminuindo com isso a sua solubilidade então o

fenômeno do do Salt al né ele é ele é governado Principalmente pelos efeitos hidrofóbicos Então os ions eles podem surgir de um agente precipitante e isso vai fazer com que você tenha aí o aumento da solubilidade nessa figura aqui típica a gente tem a curva de solubilidade de uma proteína e essa curva ela vai ser dada em função da concentração do sal em qualquer parâmetro Então você vai ter aumento da ou diminuição das concentrações do sal a menor que 0,5 mol Ou maior que aí você tem um processo obviamente de nucleação que é o aparecimento

dos primeiros cristais né isso vai se dá por sal com diminuição ou Salt al com aumento dessa dessa solubilidade existem vários métodos para a gente obter o cristal mas dentre os métodos de cristalização de proteína os mais utilizados no mercado os mais utilizados nos Laboratórios experimentais é o método chamado de difusão a vapor e dentro desse conceito Desse método de difusão a vapor a gente vai ter duas variantes que é o método da Gota eh pendurada ou como chamada o método da Gota suspensa por alguns Alguns eh eh autores e também a gente pode chamar

esse método de método da Gota sentada tá certo o processo ele vai constituir na verdade num numa pequena quantidade da solução que é chamada da Gota né a a gota dessa solução aí ela vai conter diferentes concentrações de Proteínas E essas concentrações elas vão ser obviamente equivalente ao reagente precipitante e há uma solução dentro de um determinado reservatório onde você vai ter as mesmas eh substâncias numa concentração dobrada do sistema isolado aí quando você tem esse esse ambiente você vai ter aí uma diferença de concentração né onde você vai ter a água da gota que

vai evaporar lentamente a uma determinada solução nesse reservatório e a partir disso começa a a O processo de cristalização das proteínas na gota tá bom esse é o processo principal apesar de a gente ter esses dois métodos a configuração mais comum que a gente utiliza da difusão a vapor para crescer esses cristais da proteína é a técnica da Gota suspensa ela vai ser a técnica mais utilizada apesar de gente ter as duas a da Gota suspensa a gota pendurada como vocês queiram dizer ela vai ser a mais utilizada essa figura ela tá mostrando o Processo

de cristalização da proteína por difusão no caso aqui por gota suspensa então aqui você pode ver eh como mostrado no slide anterior né você tem alguns microlitros da solução da proteína que vão ser misturadas a uma quantidade praticamente igual à solução que vai estar nesse reservatório que vão conter obviamente agentes precipitantes você vai pegar uma gota dessa mistura e vai colocar em uma lâmina de vidro que cobre que cubra ali aquele reservatório Tá certo nessa mistura eh você vai ter a relação proteína precipitante com uma gota menos concentrada do que aquela solução que vai estar

no reservatório no reservatório você vai ter uma mistura de de proteínas com solução reservatório eh nesse caso aí você vai ter numa proporção eh um um um para um na gota E então você terá água Só que essa água ela evapora da Gota para dentro do reservatório tá certo o equilíbrio então ele prossegue até que você tem aí a Difusão da das espécies volatas nesse caso água sorvente orgânico até que a pressão do vapor na água ela se iguala àquela do do reservatório e como resultado obviamente a gente vai ter aí as concentrações de ambo

tanto da proteína como dos agentes precipitantes aumentando lentamente Até formar a gota né aí esses cristais eles começam a se formar e Vale ressaltar que quando a gente tem por exemplo eh eh espécies químicas com Pressão de vapor maior do que aquela pressão de vapor da água essa troca ela vai ocorrer do reservatório para a gota E aí você tem os primeiros monocristais sendo formados por esse processo de gota eh suspensa eh a partir do processo de difusão de vapor bem materiais sólidos eles podem ser classificados de acordo com a sua refratariedade eh e nesse

caso aí eh átomos e os eles estão arranjados em relação uns aos Outros e por isso eu posso definir um cristal né um cristal ele definido como sendo um sólido no qual os seus constituintes como por exemplo átomos moléculas os zinos eles vão estar organizados no padrão tridimensional bastante definido então quando a gente fala que a gente tem um material cristalino eh eu posso definir aí esse material cristalino como aquele no qual a gente tem átomos que vão estar situados em um arranjo esse arranjo ele Se repete e e é periódico ao longo de grandes

distâncias atômicas ou seja existe uma ordem de longo alcance de tal modo que quando ocorre a sola edificação esses átomos eles se posicionarão em um padrão tridimensional que que é repetitivo ou seja cada átomo ele vai estar ligado a um átomo vizinho mais próximo e isso é que vai fazer com que nós tenhamos aí a formação do Cristal propriamente dito então quando a gente vai falar de cristal a já entendeu que a Gente precisa ter essas estruturas altamente ordenadas a gente precisa ter uma alta resolução e precisamos ter principalmente precisão na posição desses átomos para

que nós possamos ter um uma leitura eficiente daquela estrutura daquela proteína que está sendo avaliada ali a estrutura Cristalina dos minerais ela vai ser dada pela repetição periódica no espaço tridimensional Então você tem uma unidade fundamental que é Uma célula unitária Tá e ela vai ser constituída por um conjunto de átomos ou por um conjunto de íons Tá certo então essa célula aqui ela tem constituída por átomos ou Pinhos e eu posso dizer que o cristal ele vai ser formado por unidades básicas chamadas de paralelepípedos tá bom e que vão ser obviamente essas células né

que são paralelepípedos que se repetem num determinado espaço por simples Estações ao longo de três eixos Então quando você tem essas células ú Que você tem a determinação da configuração de uma célula unitária que vai possibilitar determinar a estrutura Total daquele Cristal que tá sendo formado ali então essa célula ela acaba tendo origem né em três eixos A partir eh do Quais você vai ter posições de cada átomo e que podem ser definida por eh três vetores e nesse caso três ângulos três vetores Nesse caso a b e c e três ângulos alfa beta e

Gama Tá certo se a gente considerar por exemplo Por hora o conteúdo de cada célula unitária o cristal ele pode ser visto por uma rede de pontos que vão ser derivados que são essas redes aqui né Eh E essas redes de de pontos né derivados de determinadas vértices dessas células unitárias e dentro de cada uma dessas células unitárias vai poder existir um ou mais conjuntos de moléculas que são equivalentes e que estão relacionadas entre si por operações de simetria Tá certo e E aí Você tem várias combinações que você pode gerar por essas por essas

rotações que são geradas aí nesse átomos por exemplo você pode ter combinações de 60 90 120 ou 180º e diferentes translata Tá certo de um se 1 quarto terceiro 1 meio desse eixo aí que pode ser gerado tá bom isso é importante porque eh essa esse tipo de operação ela pode possibilitar por exemplo a subdivisão dessa célula unitária em regiões menores e equivalentes que são são denominadas aí Nesse caso como a gente tem essas subdivisões de unidades assimétricas e a partir exatamente dessas unidades assimétrica que a gente pode formar aí eh e avaliar esses diferentes

tipos de monocristais que são importantes aí nos processos biológicos de diversas moléculas esses cristais né que são os cristais que que nos interessa aí que são denominados aí como os cristais de macromoléculas eh biológicas eles são eh diferentes dos cristais de pequenas Moléculas e eles acabam se diferenciado por vários aspectos né eles se diferenciam pelo tamanho por exemplo você vai ter aí eh cristais de macromoléculas normalmente bem menores eh dificilmente eles acabam excedendo o micrômetro cbico de volume uma outra diferença importante é que esses cristais eles são bem mais frágeis e por isso eles possuem

alto conteúdo de solvente eh a fragilidade desses cristais por sua vez eh acaba Incub incubo gerando interações bem mais mais fracas entre as macromoléculas biológicas dentro daquela rede cristalino E aí por isso você acaba Tendo também uma alta um alto conteúdo desse solvente nesses cristais né uma quantidade de solvente que vai de de 20 ou até mais de 75% daquela solução que tá sendo ali eh preparada aquele mon Cristal e por essa razão é que esses cristais eles devem ser mantidos em um ambiente saturado dis Solvente porque do contrário você vai ter a desidratação né

E essa desidratação ela conduzirá a quebra da dessas ligações fracas e consequentemente a destruição desses cristais e não é isso que a gente quer né a gente tem também um alto eh conteúdo dissolvente Tá certo e eh esse alto conteúdo de solvente tem obviamente consequências úteis porque o os canais de solvente de cristais de macromoléculas biológicas eles acabam Permitindo a difusão de pequenas moléculas e essa é uma propriedade que vai ser usada no processo de preparação desses derivados isomorfos e dos complexos binários da proteína e do ligante uma outra elemento que característica que vai ser

importante nesse caso aqui são as grandes dimensões de uma célula Tá certo que quando a gente comparar essas eh eh eh quando a gente compara né com as dimensões de células unitárias das Pequenas elas são bem maiores então Isso facilita também o estudo de cristalografia aqui são os diferentes cristais que a gente pode encontrar que a gente pode formar né E esses cristais de macromoléculas esses substâncias amorfas que são encontradas nas substâncias nas espécies biológ vão ser importantes aí pra gente poder compreender Tá certo então a gente já entendeu agora o que são monocristais então

a gente eh no quando a gente fala Cristalografia de Raio X por difração por exemplo a gente precisa entender o que seria esse raio x e o que seria essa difração então a gente começa trabalhando um pouquinho e falando um pouquinho do que seria esse ra x né então como eu falei para vocês a gente tem quando a gente tem cristalografia de proteínas eh é a gente vai ter aí é o o processo né de de de fração e a gente vai ter o raio x e pra gente poder entender melhor E como é que

isso tudo funciona precisa entender o que que é um espectro né um espectro um espectro eletromagnético Tá certo a gente quando a gente fala de espectro eletromagnético é um conjunto de ondas Tá certo que são organizadas de acordo com sua energia de acordo com a sua frequência de acordo com o seu comprimento de onda quando a gente fala de onda obviamente a gente tem Picos maiores né de amplitudes maiores a gente tem picos de amplitudes menores e quando A gente fala de eh de ondas a gente tem que falar de sua suas ondas seu pico

máximo que são estão nas cristas e seu pico mínimo que estão no Vale e apesar de você ter esse espectro né e vários espectros aqui podem ser vistos a olho nu e outros não esses espectros eles são sensíveis a um determinado campo então quando a gente tem por exemplo o raios de ultravioleta a gente vai ter ali eh raios que podem ser visíveis ao nosso olho que tem rados que não são visíveis Mas que são importantes como por exemplo as radiações ionizantes nesse caso aqui a gente vai ter dois tipos de radiações ionizantes que vão

nos interessar as radiações do tipo gama e a radiação do tipo x tá só que a radiação que vai nos interessar Pro Exame de cristalografia é os Rais x que vão ser importantes aí dentro desse contexto Tá certo então quando a gente fala de Rai x ou qualquer tipo de radiação que seja ionizante nesse caso aqui o espectro Eletromagnético ele não vai ter somente radiação ionizante Mas vai ter outros tipos de radiações que não são ionizantes não são radiações consideradas como radiações não ionizantes mas que também tem um poder de resolução muito grande e tem

monstra a movimentação do átomo em diferentes eh o a movimenta e o a como é que eu posso dizer uma alteração da dessa energia né dessa energia que tá sendo liberada que é liberada a partir de um Fóton de 15 eletrovolt esse essa energia é capaz de fazer com que o átomo ele se torne ionizável e quando ele se torna ionizável você vai ter aí a molécula tendo diferentes expressões dessa ionização eh pode ser expressão rotacional pode ser expressão de movimento daquela molécula pode ser expressão angular né e isso faz com que você tenha diversos

exames sendo realizados a partir disso como por exemplo a ressonância magnética nuclear A gente utiliza os spins são movimentos de átomos somente os átomos de hidrogênio que são utilizados em maior quantidade Mas a gente pode ter também as a emissão de radiações do tipo x né que são importantes dentro do contexto no qual nós estamos estudando hoje bom e quando a gente fala de radiações eletromagnéticas do tipo X os raios X eles vão ser eh um tipo de radiação eletromagnética Que vai possuir Alta Energia Tá certo eu vou abrir logo o O slide porque aí

fica mais fácil da gente poder trabalhar didaticamente então Rai X é um tipo de radiação é uma radiação do tipo eletromagnética aqui eu tô focando no espectro de eletromagnético dentro desse espectro a gente tem o raio x né E e aí o o ra X Ele vai apresentar níveis de energia que varia de 200 eletrovolt a 1 mil elov né e isso faz com que esse raio x né sejam produzidos esses produtos são Sejam produzidos através de feixes de raios catódicos que hoje a gente conhece como elétrons né que apresenta Alta Energia e ele é

desacelerado pela colisão de um alvo metálico Então quando você tem um tubo chado a vácuo E você tem essa energia sendo emitida você tem elétrons sendo excitados esses elétrons então que são excitados eles acabam acelerando e essa aceleração faz com que você tenha aí elétros ejetados tá bom Eh e aí como a gente tá se tratando de uma pola né de Clo como é que era dita a gente tem filamento de tugstênio que é aquecido esses elétr acelerados porque você acaba tendo uma colisão com moléculas do gás que estão ali presas naquela região com isso

você tem ionização e liberação de luz então você posso dizer que a energia que é irradiada né pela os as energias do da energia Eletro eh da radiação ionizante varia de 0,5 a 3 angstron tá bom esse Intervalo é um intervalo que vai ser interessante porque a gente vai utilizar Exatamente esse essa energia no processo de cristalografia estrutural Tá certo porque esses comprimentos eles acabam sendo semelhantes a distâncias interatômicas que vão ser analisadas aí nesse processo tá bom E aí quando a gente fala de raio x A gente tem vários tipos de de raio X

que que que são estudados e que que nos interessam mas nesse caso aqui a gente vai ter duas que Nos interessam bem mais que é e mas aí a gente precisa falar também que a gente tem outros tipos de RX né mas nesse caso aqui a gente a gente só vai focar no ra x de característico e no ra x de frenamento Tá certo primeiro é esse raio x aqui chamado de raio x de característico o raio x de frenamento agora consegui passar ele vai ser uma perda da energia cinética que vai ser dada poren

ou por freio né você tem aqui ó eh Um elétron sendo incidido esse Elétron é atraído pelo núcleo algo ele sofre um desvio dessa trajetória Tá vendo você tem um freio Você tem uma desaceleração desse elétron né então ele entra em contato com o núcleo no átomo e ele acaba sofrendo esse desvio e libera energia na forma de raio x também então é uma das energias também importantes aí dentro desse contexto uma outra coisa que a gente tem que entender quando a gente vai falar de ra X é a questão de interação desse raio x

com a matéria que Vai nos interessar no processo de cristalografia bom então o a gente já viu que o que seria o raio x agora a gente vai entender como é que no processo de difração de raio x e é importante que seja dita que esse fenômeno de difração de raio x ou da RX ele vai representar um fenômeno onde a gente vai ter interações entre o feixe de raio x incidente né e os elétrons desses átomos componentes que vão estar dentro de um material nesse caso aí um Monon cristal e eles vão estar relacionados

obviamente com o tipo de espalhamento que é o espalhamento coerente e e a partir de uma interferência que nós chamamos de interferência construtiva isso tudo a gente vai entender a partir do fenômeno que nós chamamos ou da lei que nós chamamos lei de black Tá certo então vocês já entenderam que pra gente ter difração Vai ser necessário o fenômeno de espalhamento e o fenômeno de Interferência construtiva que a gente vai discutir agora então toda vez que a gente falar na técnica de difração você ele você vai entender que ele vai permitir eh e vai consistir

no espalhamento coerente esse espalhamento coerente obviamente ele é resultante da interação que existe entre as ondas eletromagnéticas nesse caso a onda em específica é a onda de raio x né esse raio x com os seus elétrons desses átomos de um determinado material e Nesse caso um material em específico vai ser a a os monoclonais que são as os cristais Tá certo então vamos pensar que se você tem um material e você não sabe se esse material seria ou não interessante você vai pegar esse material vai colocar ele num difratômetro você vai realizar a difração de

raio x e isso vai gerar ondas de raio x esse essa onda de raio x Então vai penetrar naquele material e você então irá reagir Com os elétrons desse átomos desse material e então você vai realizar o fenômeno de difração de raio x só que para que essa difração aconteça é necessário que nós tenhamos tanto espalhamento desses elétros coerentes que vão ser importantes como a interferência construtiva então primeiro é espalhamento coerente vocês já sabem como é que é que a gente viu nos slides anteriores que a gente tem dois tipos de Raios X que são

importantes para esse Processo de cristalografia que é o raio x coerente o raio x de frenamento ou de freio como vocês queiram falar e o o de interferência é preciso que a gente tenhamos agora uns conceitos que são legaizinhos e que para vocês poderem entender melhor o que seria uma onda ou a interferência construtiva Observe que você tem aqui ondas como eu falei para vocês com picos de cristas né e com amplitudes aqui altas amplitudes nas suas cristas E você tem ondas com baixas Amplitudes com picos aqui menores mas que elas se interpõem entre si

simultaneamente tá vendo enquanto que aqui você tem um um uma crista e um e um e uma um vale que você vê que não elas não se interpõem Mas você vê que você tem enconto dessas duas ondas Então quando você tem duas ou mais ondas que passa por um ponto né em específico em um determinado instante você vai somar né então a determinação resultante da soma Algébrica das perturbações de cada onda é somada e quando essas duas ondas atingem de forma simultânea o mesmo Ponto você vai ter dois princípios de superposição ou sobreposição superposição ou

sobreposição como eles costumam colocar no no nos livos então Então quando você fala de uma onda construtiva ela seria o somatório de dois Vales ou de duas cristas resultante dessa amplitude ou desse pico de onda que vai ser igual à soma do das das Amplitudes que foram geradas e quando você diz que uma onda é uma onda destrutiva é porque essa onda você tem aqui uma crista em um vale e você tem aí o pico dessa crista o pico desse vale diferentes e e você vai ter diferentes somas de amplitudes Mas você consegue também quando

essas duas ondas se encontram calcular de forma algébrica esses dois pontos tá certo então quando você fala da onda eh do processo de difração é justamente A combinação desses dois fenômenos o fenômeno de espalhamento e o fenômeno de interferência construtiva E aí quando os fótons de raio x de um mesmo comprimento de onda que foram espalhados de forma coerente interferem-se entre si de um modo construtivo você vai ter picos de difração que você vai poder avaliar e poder caracterizar ali a sua proteína e é importante porque é justamente A partir dessa técnica a Partir desse

princípio que a gente pode obter informações né da composição química da estrutura dos Cristais do tamanho desse cristalino da orientação preferida e também da espessura da camada Então se a gente admitir por exemplo que a gente tem um feixe monocromático né de um determinado comprimento de onda e que esse feixe monocromático nesse determinado comprimento de onda ele vai incidir sobre um determinado Cristal a um Determinado ângulo nesse caso ângulo teta eh você tem aí o efeito explicativo de uma interação que vai ocorrer e que é representada e explicada pela lei de B certo então nessa

figura aqui ela vem mostrando Exatamente isso ela representa esse esse fenômeno da lei de Black onde a gente tem aqui n x l vees Du vees D Seno do ângulo teta onde o ângulo téter el vai corresponder ao ângulo que vai ser medido dos feixes incidentes que são determinados e pelos planos dentro do Cristal E você tem lambda que é o comprimento de onda e d que é a distância que é gerada entre os planos do átomo e n que é a ordem da difração Tá certo esse fenômeno aqui ele vai ser registrado por instrumentos

Geralmente os instrumentos tradicionais que vão medir esse fenômeno são difratômetro e e a partir do método em pó a gente tem também as câmaras monoclonais só que essas últimas naturalmente com seu uso Restrito por causa de situações específicas no caso a gente não consegue determinar os parâmetros cristalográficos tão tão precisos né E principalmente aqueles que nos interessa PR análise mesmo da cristalografia Então agora que a gente já conhece o princípio do Ra x da difração e a formação dos Cristais eh a gente vai só dar uma pincelada aqui falando que você tem uma fonte de

raio X que vai emitir uma determinada radiação essa radiação ela Vai atravessar a amostra onde você tem uma proteína Tá certo essa proteína ela vai sofrer o que nós chamamos de difração E aí você tem um anteparo que vai estar posicionado aí fr a a essa amostra que vai captar os raios que vão ser desviados da sua trajetória tá certo aí quando você tem esses raios eh você tem emissão de de de uma de energia que vai estar associado ali aí você consegue identificar obviamente o elemento que está sendo avaliado e analisado nesse Caso aí

então quando você mede o ângulo de difração desses raios Você conhece o comprimento de onda você pode esboçar o posicionamento dos átomos e e saber as cadeias de aminoácidos que compõe essa proteína também eu preciso falar para vocês que quando a gente tem esses cristais de macromoléculas eles estão ali eh eh diante da dos raios X né eles acabam sendo muito sensíveis e muitas das vezes é necessário que a gente utilize vários tipos de cristais para Que a gente possa obter um conjunto de dados que seja necessário pra gente poder seguir para os próximos etapas

noos próximos passos nesse caso Tá certo então a cada a cada coleta que a gente fizer eh deve ser feito o resfriamento do Cristal né Eh e esseesse esse resfriamento ele tem que ser instantâneo no fluxo de nitrogênio gasoso que vai variar vai variar não um fluxo eh fixo né de aproximadamente 100k Né que é chamado de 100 Cristal Tá certo por que isso porque é exatamente isso que vai permitir com que nós tenhamos uma resolução eh melhor e que a gente tem assim a redução de danos que possam ser danosos para o princípio da

radiação direta naquele Cristal que tá sendo formado ali e com isso eu acabo aumentando o tempo de vida daquele Cristal e dessa forma obviamente Eu tenho um melhor aproveitamento daquele material né Porque se eu tivesse apenas um único Cristal eu podia fornecer dados que seriam insuficientes para que a gente pudesse ver a resolução daquela estrutura atômica daquela molécula então e não é preciso realizar uma integração né com dados de cristais diferentes você precisa repetir isso de forma coerente para que a gente possa ter então exatamente por isso é interessante de que cada conjunto de de

de que sejam geradas por aquele Cristal ele forma um Conjunto de dados que esses dados eles precisam ser analisados o passo a passo então você pode realizar várias coletas você pode escolher o melhor conjunto de dados da de representatividade daquela estrutura proteica né então Toda vez que você for coletar os dados a a frio você eh precisa verificar como é que que foi a qualidade daquele Cristal se o resfriamento realmente proporcionou uma organização interna daqueles cristais se fori necessário e esse ramento para que Nós tenhamos um um bom uma boa coleta e se você vai

anotando no seu caderninho porque toda vez que você for fazer você já tiver esses princípios já padronizados você minimiza tempo e aumenta a qualidade dos seus cristais obviamente Tá certo Eh aí você vai apresentar os seus dados de forma mosaico nesse caso né Aí você vai ter também alguns elementos que vão ser importantes para poder gerar esses dados e uma coisa que é interessante de Ser Dita é que a a distância do detector eh ao Cristal ele deve ser regulada de forma a chegar mais próximo da da daquela melhor resolução né Eh e isso acaba

sendo um aparato um parâmetro limitado à qualidade do Cristal se você não não for fiel a ess distância você acaba tendo um cristal de má qualidade então de posse dessas imagens que que é o que nos interessa você pode realizar por exemplo a indexão e poder determinar por exemplo os diferentes grupos Espaciais Você pode verificar por exemplo as dimensões a orientação de cada célula unitária que vai ser importante você pode eh estimular estimular por exemplo a a mosaici dade daquele elemento do Cristal a partir da da distância desses desses eixos na rede Você pode verificar

o padrão de difração que é importante né E que possa ser possível para você determinar por exemplo o tamanho os eixos desses cristais no Espaço Real tá então esse esses Passos eles vão ser necessários pra gente poder planejar direitinho e você lançar estratégias né lançar a mão de estratégias de coleta de de dados que sejam eficientes que possa obviamente minimizar o tempo né E que possa maximizar obviamente os resultados que é o que nos interessa até porque é um exame uma método uma técnica que não é uma técnica barata então todos esses cuidados precisam ser

tomados Porque caso contrário a gente acaba se perdendo no processo de qualificação e desse desse dessas análises desses resultados que vão ser importantes e essa estrutura aqui essa figura ela foi uma figura a ex saída do Lening né mas ela ela tá aqui porque ela representa um uma etapa na determinação de cristalografia de R x né produzida por difração eh e aí você vai ter aqui a espécie espécie da Charlote tá a baleia Charlote E aí ele pega a mioglobina Dessa baleia e começa a avaliar né então eh ele e em a aqui você tem

um padrão de difração de raio x né que foi gerado a partir D esse cristal da da proteína em B Você tem os dados que foram obtidos a partir desse padrão de de de fração para obtenção desses dados Aqui foram esses dados foram eh calculados através da do mapa de densidade eletrônica tridimensional que foi gerado Tá certo em C você vai ter aqui a a estrutura m modelada no mapa de densidade Eletrônica Tá certo e em D você tem a estrutura completa dessa mioglobina na Charlote então a estrutura você pode pegar na no PDB tá

dessas proteínas Observe que essa proteína aqui tá com seu ligante e exatamente essas interações que a gente observa por por exemplo docagem molecular que nos interessa então a cristalografia por rax é uma técnica que a gente utiliza e pra gente poder avaliar a estrutura dessas proteínas essas proteínas são Depositadas no banco de dados nesse caso o o prot Bank que é o PDB E aí a partir disso a gente começa a verificar as interações dessa proteína dessa molécula em si quer ver n n parte da dessa molécula proteica e verificar quais os ligantes quais os

receptores que podem interagir nessa nessa relação aqui nessa interação que possam vir a favorecer uma inibição ativação de de uma determinado mecanismo eh celular né E esses mecanismos possam ser eh inibidos ou Ativados para ajudar na cura no no tratamento de determinadas doenças patologias como tudo bem se a gente conseguir obter e um experimento de difração de R x bem sucedido nós obteremos informações sobre os parâmetros da célula unitária do Cristal né a gente vai ter aí parâmetros como por exemplo e parâmetros de rede e de simetria né e a gente também vai ter e

informações sobre por exemplo o módulo Do fator da estrutura que é conhecido e chamado como fator de estrutura observado que são as fobs e para cada reflexão de índices também a gente pode também avaliar aí eh O hkl que é o índice de mil né que para cada reflexão ocorrendo no processo de fração de Raio X é dado uma direção diferente e a gente começa a a entender e e e avaliar esses parâmetros então pra gente poder resolver qual é a estrutura necessária Além da informação dos módulos de FOB a gente tem também informações sobre

o fator da estrutura que é perdida durante o experimento de difração de raio x Tá certo então é importante a gente ter esses parâmetros porque ex são exatamente esses parâmetros que vão nos ajudar a entender cada um dos problemas e como é que a gente pode resolucionar esse problema né que que tá sendo gerado aí bem aí a gente tem aí um calcanhar de Aquiles né porque A gente tem um problema de resolução dessas estruturas eh e é e é dado Exatamente porque os dados que são disponibilizados para a análise el não somente análise das

intensidades eh da difração do raio x pelo Cristal eh a gente obtém apenas os módulos dos valores de estrutura isso é um fator bastante limitante para a resolução das estruturas moleculares porque acaba impossibilitando o cálculo da função da Densidade eletrônica por séries de furrier né com ausência de Fases a gente tem furrier por exemplo quando a gente faz vai fazer análise de essa Nosa magnética nuclear quando a gente vai fazer espectroscopias de infravermelho mas aqui a gente a gente acaba tendo essa delimitação exatamente por causa desse cálculo da função da densidade eletrônica Tá certo exatamente

por causa dessa dessa limitação que existe então é um problema que é conhecido e é chamado Problema das fases E aí eh quando a gente tem esse problema das fases da da cristalografia a gente acaba tendo métodos que vão ser utilizados para que a gente possa resolver esse esse esse problema e esses métodos são chamados de métodos diretos porque eh devido a r steak que a gente tem computacionais da eficiência eh é um método é que considerado obviamente como coerente e que vai utilizar e é utilizado exatamente para essas pequenas Moléculas né então proteínas como

macromoléculas esse método dificilmente ele vai vai poder ser aplicado mas para nesse caso em específico das moléculas menores eh a gente pode aplicar E aí a gente vai ter três tipos de métodos utilizados nesse caso para resolução de estruturas de cristalografia de X por de fração aí você tem o método da substituição molecular Que nós conhecemos como Mr que tem o método de substituição isomórfica o mi e a gente Tem o método de dispersão anômala dos múltiplos comprimentos de onda que são chamados de mádia o método de substituição molecular o Mr ele é um método

que ele é baseado no princípio de que você tem macromoléculas e essas macromoléculas elas vão apresentar alta homologia sequencial tendendo a ser novelar en novelar de forma bastante similar e dessa forma a a proteína cuja estrutura já tenha sido determinada ela serve como Modelo inicial para que nós possamos obter um conjunto preliminar de Fases que possam ser eh subsequencia realmente utilizadas no processo de refinamento da molécula o sucesso na verdade desse método ele está no fato de que hoje em dia Existe uma grande número de macromoléculas que já se tem conhecimento delas que são depositadas

no banco de dado do PDB que é o prot datate Bank e o PDB que foi criado desde 1971 ele é um arquivo digital de Macromoléculas biológicas especificamente proteínas e possui atualmente em torno de 186.000 estruturas que são depositadas nele né Então essas proteínas às vezes também eu falei proteína mas às vezes a gente tem depósitos de ácidos nucleicos de vírus eh de vírus de bactérias de espécies espécie humana que a gente pode chegar ali pegar essas proteínas e e avaliar e e gerar esse método a partir da Substituição molecular bem o método de substituição

isomórfica o Mr ele ele é dado eh pela dependência né da obtenção de cristais que são derivados isomorfos com átomos pesados que tem uma maior contribuição para com o espelhamento eh o que que isso quer dizer né Eh um quando eu tenho por exemplo um derivado isomorfo perfeito ele vai ser perfeito porque eh você vai ter uma única variação do mapa de densidade eletrônica e isso se deve Exatamente por causa da posição desses átomos pesados então Toda vez que você introduzir um átomo ele deve ser feita de modo a não afetar essa estrutura macromolécula do

da proteína né aquela estrutura original daquela proteína não deve ser afetada certo e a gente aí tem o o segundo método que é utilizado que é o método de dispersão eh conhecido como método de dispersão anômala de múltiplos comprimentos de onda que é chamado de Mad e esse método ele diz que quando Você tem elétrons esses elétrons eles se encontram em camadas mais próximas do núcleo o tratamento de dados eh devido ao espalhamento desses elétrons ele deve ser cuidadoso Por que que ele deve ser cuidadoso porque uma vez que a força de interação entre esses

elétrons e seu núcleo eh não não pode ser mais desprezada eh O que é que vai acontecer o e e além dela não ser desprezada o o elétron também não pode ser mais tratado como livre eh e aí o que que vai Acontecer devido a essa força de interação com o núcleo vai existir uma introdução de um termo Imaginário ao fator de espalhamento atômico que depende do comento de onda da radiação E aí quando a gente pensa nesse nesse princípio aí desse comprimento de onda e e dessa radiação a gente vai ver que eh quando

a gente tem né conhecimento acerca da amplitude das fases isso vai permitir com que você tenha a Reconstituição da da da densidade eletrônica do do Cristal então quando os raios x eles incidem sobre o um cristal o mesmo vai gerar feixes difratados então toda vez que eu tiver eh uma radiação difratada essa radiação ela vai ser resultado da interação exatamente desses Campos elétricos de radiação de raio x com a nuvem eletrônica desses átomos desses Cristal E aí sim a gente vai poder afirmar que a interpretação padrão que é dada a esse processo de Fração de

raio x ele começa a nos fornecer informações sobre sobre a parte eletrônica desse Cristal e Mais especificamente sobre essa densidade eletrônica que tá sendo gerada a partir desse Cristal a partir da interação desse Cristal Obviamente você tem essas informações desse Cristal Tá bom então quando você tem uma onda total que é espalhada por um pequeno volume uma determinada posição que nós chamamos de posição R né dada por essa equação zinha Aqui que tá sendo demonstrada você vai ter uma amplitude proporcional àquela densidade eletrônica eh e uma defasada fase obviamente aí para que você possa ter

esse espelhamento desse átomo é necessário que você tenha que realizar esse somatório de dessa desses dessa radiação dessa energia que tá sendo espalhada e sobre toda a distribuição espacial eletrônica você precisa também ter essa informação para que você possa calcular Então para que você possa obter Essa pressão né do fator de espalhamento é necessário que você consiga realizar o somatório sobre toda a distribuição espacial desses desses elétrons né dessa NV eletrônica para que você consiga obviamente descrever essa expressão de espalhamento que é dado em f Com como uma expressão integral do dos parâmetros que são

necessários para que ocorra aí a dispersão anômala dos múltiplos comprimentos de onda chegamos então a última etapa de Determinação da estrutura das das proteínas Dimensional que é a etapa chamada de refinamento Tá certo essa etapa conhecida como refinamento ela é um processo que Visa a gente poder encontrar uma melhor concordância que possa existir entre o modelo proposto paraa estrutura da molécula e a estrutura real né então a gente vai ter aí eh para que a gente possa conseguir alcançar esse objetivo várias etapas Então para que você você possa fazer o Refinamento você precisa de vários

ciclos do mesmo tá certo para que todos os átomos que estejam presentes naquele modelo ele represente de maneira fiel a realidade experimental medida daquela molécula que a gente conhece da estrutura real dela tá certo então Eh esse esse esse processo né que você tem eh ele vai estar em concordância e e deve refletir e numa igualdade entre dois fatores que são importantes que são as estruturas eh calculadas que são Chamadas de fcal e os seus fatores mais próximos possíveis que são estruturas que são fatores chamados de fatores observatórios que é o FOB Tá certo então

Eh é necessária a realização não não somente de de desses fatores mas também é necessário que haja o acompanhamento da qualidade desse processo E essa qualidade esse acompanhamento é feito pelo cálculo do fator R Tá certo todo o processo vai ser avaliado com esse cálculo aí então esse esse fator R vai Ser uma medida de similaridade entre o modelo crist lograf que é utilizado e os dados experimentais de fração de ra X então o que eu quero dizer com isso que esse esse acompanhamento de qualidade e processo ele vai ser a medida né Eh de

quão bem estruturada e refinada prevê aqueles dados observados naquele experimento de di de ra X então ele que vai te dizer se realmente aquele aquele modelo ele foi bem bem estruturado se se ele representa realmente a proteína real E tudo isso então quando a gente pensa né nesse nesse pressuposto a gente lembra que para estrutura cristalográficas de proteínas resolvidas a resolução ela precisa ter uma resolução menor do que dois angst tá certo espera-se que esse fator R então ele consiga atingir valores que sejam menores do que 20% entendeu para que eh a gente possa realmente

dizer que não o o trabalho foi bem feito você tem uma boa qualidade e você tem os parâmetros Que estão sendo aceitáveis Tá certo e aí a gente tem mais um detalhe a ser falado aqui sobre esse esse esse fator aí de espalhamento de qualidade do processo é que como esse R ele pode ser minimizado artificialmente ele pode levar em consideração a redundância dos dados ra x uma pequena percentagem dessas reflexões eh que são excluídas no refinamento elas podem ser utilizadas no conjunto de testes que possam ser calculado com um novo R que aí não

não Vai ser mais chamado de R vai ser chamado de R livre né então esse R livre ele é isento da minimização artificial então normalmente o r livre ele possui um valor um pouco mais alto do que o r e normalmente não excedendo 10% do R para as estruturas refinadas e de alta resolução Então isso é importante para poder também manter a qualidade aí do do de todo o processo que é feito a partir da do refinamento da da cristalografia Tá certo bem pessoal é isso E aí eu vou Trazer aqui para vocês alguns algorítmicos

e programas computacionais que você pode utilizar para poder obter essas estruturas tridimensionais dessas proteínas aí já entra mais na parte de bioinformática então isso vai requerer obviamente eh que vocês tenham o conhecimento da bioinformática dessas ferramentas que vão ser úteis para que vocês possam avaliar cuidadosamente essas estruturas eh geralmente você tem pacotes gratuitos e você tem pacotes Pagos também à medida que você começa a trabalhar com isso você vai vai sabendo e conhecendo vários programas que são importantes para você poder trabalhar eh aqui a priori eu tô trazendo só a nível de curiosidade mesmo você

vai ter o xds por exemplo para você começar a trabalhar com a de raio x as fases iniciais do cálculos e você pode fazer com esse programinha chamado faz que é importante também a estrutura modelada você pode fazer com o programa chamado Mr Coach também que é é super legal e finalmente você pode fazer também as estruturas tridimensionais e pode pode Direcionar para esse programa aqui que é chamado de ref Mac 5 macat na verdade ref macat Tá certo ou ref ma 5 também alguns ou também o Fênix que as pessoas utilizam muito tá certo

eu gostaria de agradecer a vocês e mais uma vez reforçar aqui a gente vai fazer uma resenha de trio vai ser vão disponibilizar no ava e por favor Disponibilizem no ava e façam seus trios de modo que aquelas pessoas que não tê contato e que não estão registradas no ava possam fazer e colocarem suas seus materiais lá e até um próximo encontro um abraço a todos