o Olá alunos sejam bem-vindos novamente a aula de imunologia Clínica dando continuidade os testes imunológicos que a gente utiliza na prática da imunologia Clínica a a nós vamos falar hoje um pouquinho sobre o Vasco inglot então assim blot ele é uma variação né do Norte em blogs e dos ordem lote né que analisam proteína é que não usam DNA RNA e Oeste ele é o método que a gente Analisa proteínas né Então na verdade o método de separação de proteínas as utilizamos esse método que é feito em gel primeiramente para separar as proteínas por peso
molecular e por densidade né que some esse peso molecular e por carga elétrica de um gente aplica uma carga elétrica né proteínas são formadas por aminoácidos lembrando disso nesses domínios e isso pode tirar carga elétrica positiva e negativa o carga elétrica neutra e quando a gente aplica essa carga elétrica as proteínas elas vão migrando né é para os polos E além disso elas migram por um tamanho né então esses gel esse gel oposto ou por polic lambida ou por agarose então a gente consegue ter um tamanho né nesses polibras dependendo da concentração que utiliza do
gel e abro tem nada vai migrando por esse polímero então aplicando essa carga elétrica ela vai migrando e a gente consegue ter um uma separação por tamanho e carga elétrica então a definição é um método de separação de proteínas né por peso molecular e por essa carga elétrica e almoça deve ter no mínimo possível de contaminantes Então como lipídeos ácidos nucleicos então a gente utiliza métodos de separação um desses aí essas proteínas para evitar esses contaminantes que podem influenciar na separação a desse dessa dessa mostra então a diferença tipos né dê a homogenização gente vai
utilizar seja mecânica por pressão o descongelamento ultrassom né É ultra-sônica ou por lizzy como detergentes enzimáticos Então a gente vai obter essa proteína por diferentes tipos de metros isso é de escolha de cada laboratório Então dependendo do tipo de laboratório indicam utilizado que a gente vai utilizar para separar as proteínas a gente vai ter um tipo de separação diferente então esta mostra ela é colocada geralmente em um vários né é outro cônico adicionado o detergente né uma solução de lise celular no tecido também e após a centrífuga a coletar o sobrenadante Então vocês vem aqui
que é adicionado a substância né lítica Se for por em uma substância química e a gente coleta-se sobrenadante então Joel obter as proteínas A partir dessa dessa coleta do sobrenadante Oi e aí a primeira fase vai ser a separação no chão tá então é esse gel ele é colocado na intenção mesmo aqueles Pocinhos a gente coloca um pentinho aqui espero resfriamento esse gel então ele é um carboidrato né que vai manter uma capacidade de solidificação e as amostras vão percorrendo entre ele dependendo da concentração que investir Lisa desse esse polímero né é esse gel ele
vai ter tamanhos maiores ou menores então se tiver uma concentração muito alta substâncias pequenas vão atravessar mais facilmente do que as grandes se a concentração por exemplo de um por cento aí a os polímeros eles vão ter um espaçamento maior entre eles então substâncias proteínas grandes o caso as vão atravessar mais facilmente por entre os a o políbio tá migrando mais facilmente Então dependendo do e mostra que a gente vai ter geralmente João uma nossa conhecida né então eu quero pesquisar a antes de nos HIV eu sei que o tamanho né vai variar de gp120
kilodaltons gp41 1724 Então vamos antígenos presentes na no HIV que a gente sabe o tamanho mais ou menos né é o peso molecular dessa substância E a e aí sim a gente vai identificar né vai obter um gel com tamanho mais específico para isso então a mostra a gente vai remover esses contaminantes tá para ter uma análise mais fiel em relação à ao que a gente está procurando porque pode ter proteínas que tenham o peso molecular semelhante né a desses antígenos está procurando utilizo tampões detergentes soluções para obtenção está E aí depois a gente coloca
no Gel e vai aplicar uma carga elétrica tá então essa carga elétrica vai ser aplicada com mostrado que na próxima figura as proteínas geralmente Elas têm cargas elétricas negativas então elas migram para o pólo positivo tá então aqui a gente vê a separação porque o daltons o tamanho peso molecular primeiramente a gente vai usar um padrão esse padrão é uma mostra conhecida que a gente vai saber né aplicando por uma hora aproximadamente a em um gel a ou tamanho de cada substância aqui então a gente tempo para acompanhar esse padrão para gente identificar quais seriam
os tamanhos dos pesos moleculares essas proteínas que percorreram União tá então gel de um a um e meio por cento aplica carga elétrica do Polo nem Oi para o positivo ao contrário de material genético tá que é do Positivo para negativo as proteínas migram do polo negativo para o pólo positivo então assim elas vão obter separações por tamanhos diferentes então cada moscada pô se vai ter uma mostra específica percorrendo esse gel e após percorrer isso a gente vai ter que transferir essa essa nossas por uma membrana de nitrocelulose para assim a gente obtém um método
de immunoblot tá o Western blot é um método de separação de proteína só que a gente não consegue identificar somente pelo tamanho qual tipo de a antígeno Kristen então a gente precisa realmente é ter uma certa especificidade o anticorpo ele não se liga no Gel tá então não vai ter ligação específica ali no Gel e conseguir identificar se realmente é é aquela amostra de interesse gente tem que aquele antígeno que a gente realmente está procurando então é a gente não consegue marcar de modo específico gel para isso a gente transfere as proteínas obtidas no gel
para uma membrana de nitrocelulose para isso a gente também vai aplicar uma carga elétrica né do polo negativo para o positivo então analisando aqui na figura a gente consegue identificar né que do gel é aplicado uma carga elétrica negativa para positiva na membrana Então vocês vem aqui as proteínas que estavam na mesma posição no Gel elas vão ficar mesma posição na membrana de nitrocelulose essa membrana de nitrocelulose ela vai ser então é inativada tá porque ela tem capacidade de ligação com proteínas tá que ela se liga proteínas a praia evitar ligações inespecíficas dos anticorpos que
a gente tem de interesse a gente vai inativar essa membrana a gente pode utilizar soro bovino fetal tá gente compra e Nativa isso tá ou a gente utiliza a leite Molico tá proteína do leite então a gente pode utilizar especificamente essas proteínas né e na ativando o restante da nitrocelulose onde não tem proteínas ligadas ou seja as proteínas marcadas aqui ó se passaram da do gel para membrana ficou na mesma posição e o restante da membrana vai ser inativado com o soro bovino fetal o à proteína do leite tá então só vai ficar as proteínas
específicas né É marcadinha desses pontos Oi e aí sim a gente vai conseguir identificar de modo mais específico Então a gente vai partir para interação entre antígenos e anticorpos também para esta técnica então após a mostra italiana presas nitrocelulose e inativar o restante da membrana nós colocamos um anticorpo primário contra o antígeno específico tá então para você a proteína é do coronavírus Então a gente vai vez que colocar um de corpo contra a proteína específica de coronavírus a gente em Cuba isso depois lava e posteriormente adicionado o anticorpo né secundário tá então esses bem aqui
ó um anticorpo secundário conjugado com uma em cima tá vai ser de cor secundária se liga no anticorpo primário que é da nossa mostra interesse que é o conhecido né pela gente já e a nossa mostra interesse é o antígeno aqui então esse alvo né para treinar alvo e ele estava pesquisando que a gente corpo conhecido já a gente obtém por aqui e esse é o secundário marcado com uma cima Então essa em cima utilizo substrato e a por meio de um método colorimétrico ou de quimiluminescência né e dois métodos diferentes a gente pode é
obter a coloração então para análise do teste a gente consegue identificar agora por immunoblotting tá diferente do resto que a gente consegue identificar vi anticorpos qual proteína tá presa ali na membrana de nitrocelulose qual a proteína que a gente realmente obteve Então essa mostra é depois encubada né e identificada a gente em Cuba com a enzima né junto com anticorpo secundário realiza-se lavagem de abstrato vai marcar pequenas bandas então aqui você consegue identificar né nessa figura tamanhos moleculares diferentes de preço a 120 logo aí vê no caso né 6655 4131 24:17 Tá então os anticorpos
específicos contra nessa proteínas do vírus HIV vão se ligar tá contei gp160 que é o fragmento completo seu presente bicho de ter 41 são os fragmentos de ficar 160 A 24:17 tá então os anticorpos vão se ligar aqui especificamente a gente faz lavagem tá em Cuba com o anticorpo associada em cima após incubação a gente faz mais uma lavagem para sair o que não se ligou tá e a gente adiciona o substrato E aí sim a gente vai ter uma marcação olha eu aqui você consegue identificar a marcação da AGP 121 160/120 41 e a
pé 24 tá então a presença das bandas representa a reatividade dos corpos e PC e vai ver nesse caso aqui tá tem um anticorpo anti-ige pensando 60/120 já foi 41 e ap24 marcadas aqui então pela análise do a immunoblot a gente consegue identificar sim especificamente quais proteínas que foram separadas diferente do método do Oeste inglot que é apenas a separação por tamanho e carga elétrica então só recapitulando né o western-blot ele é o método né chamar de burra não né é o método que a gente consegue identificar o peso molecular né que é o tamanho
pela carga elétrica aplicada tá então do polo negativo para o pólo positivo e quando a gente passa do gel para membrana de nitrocelulose Aí sim após bloquear a gente consegue hoje especificamente Quais antígenos que a gente tem presos nessa membrana se realmente esse peso molecular é o antígeno de pesquisa que a gente tava procurando então é esse método immunoblot ele vê complementar o método de West para realmente a gente identificar de modo bem específico Quais antígenos que estão presos tá então são é um método complementar de identificação é assim que a gente consegue realmente identificar
se serve como um método né secundário para identificação presidente do do do HIV tá então a gente vai ver ainda os testes né E no caso do do vírus da imunodeficiência humana ele diagnosticado fazer um teste rápido que a gente sério triagem e depois faz um teste complementar né é um diagnóstico padrão ouro pode ser por um Killing time luminescência um Elisa e o teste West ele vem complementar realmente né para identificar sei se padrão é esses antígenos mesmo do HIV então o teste que vem associado né Para a gente realmente diagnosticar o HIV nesse
caso então Oeste serve para identificar especificamente e não somente proteínas de Diagnóstico mas como pesquisa também de utiliza muito o s com o pesquisa para poder identificar alguns tipos de proteínas né É É para ver a parte funcional metabólica que a gente está procurando amiga o celular que se bota mesmo corpo físico Então as identificações são bem importantes é um método que a gente consegue separar e até mesmo obter proteínas tá pelo é sem e identificar pelo immunoblot tão para que o sistema entendido a diferença entre o outro tá Oeste separação e o immunoblot que
é complementar do s para a identificaçã é específica até a próxima aula um abraço e [Música]
