Desenvolvimento e Produção de Vacinas

eu gostaria de parabenizar o gol a comissão organizadora de patrocinar esse evento e agradecer muito o convite de participar o que eu acho muito importante a divulgação para todos os profissionais da saúde eu vou falar sobre a produção o desenvolvimento e produção de vacinas vacinas como vocês devem saber que são produtos biológicos que capazes de estimular uma resposta imune à produção de anticorpos os anticorpos são proteínas produzidas pelo organismo capaz de neutralizar esses antígenos as vacinas a servem para a erradicação das doenças prevenção de epidemias e claro redução do número de óbitos a pesquisa o

desenvolvimento de vacinas teve início há mais de 200 anos com george gênero na na época da varíola bovina que tinha muitas pessoas afetadas jenner e e pasteur foram os primeiros a fazer o hino profilático gênero viu a pegou uma moça com um novo varíola e inoculou no meninos ao sadio e viu que o menino ficou imune a varíola humana começou aí então o desenvolvimento de vacinas de 1777 1925 era desenvolvido uma vacina a cada cinco anos de 1990 2000 já eram já era uma vacina a cada ano para fazer o desenvolvimento de vacinas precisamos primeiro

identificar o antígeno nec o determinante gênico fazer a produção desse antígeno testar a eficácia em animais em faro na fase pré clínica pra ver pra ver o efeito dessa vacina e depois estudos em humanos na fase clínica 1 2 e 3 é só depois dessas é desses estudos de eficácia é que se entra numa linha de produção e tem se à aprovação para o mercado é um processo complexo porque precisa ter uma estratégia de melhor relação custo-benefício objetivo de licenciar um produto seguro imunogênico e eficaz a produção deve ser consistente deve ser também mais rápida

possível e de baixo custo precisa ter o antígeno alvo caracterizado o certificado ele pode ser vivo atenuado ou inativado fragmentado como no caso da vacina influenza ou de dna ou vacina recombinante entre outras essa essa vacina ela deve mimetizar a resposta natural isto é fazer a produção de anticorpos pra poder neutralizar e proteger a pessoa só tendem pode se estudar de vants que potencializam essa resposta da vacina e também no processo de desenvolvimento de vacinas r é necessário estudar as formas de aplicação que deve ser o mais fácil possível de se administrar é um investimento

alto de 10 a podendo chegar a 1 bilhão de dólares e o desenvolvimento de uma vacina pode durar de um a vinte anos a 1º a primeira etapa do desenvolvimento da vacina é ter o determinante antigénico é o antígeno alvo para depois fazer o cultivo desse antígeno depois do cultivo vem a etapa de processamento que uma são várias etapas que em que se vai purificar o antígeno e para depois ter o produto concentrado a granel ainda não é a vacina é o princípio ativo que vai fazer a composição da vacina em todas as etapas temos

vários testes de controle de qualidade depois de aprovado pelo pelo controle de qualidade é que se faz a formulação eo envase para no final poder obter obtemos a vacina todo esse processo pode demorar de 15 a 40 dias então é muito longo onde o processo de produção de uma vacina para o desenvolvimento cada etapa estudada então por isso que pode demorar até 20 anos para se ter o produto final a vacina nos frascos embasadas a primeira etapa o cultivo do antígeno mas antes do cultivo de antígenos é pré necessário preparar um estoque desse antígeno então

temos a cepa vacinal que é o determinante antigénico que vai compor a vacina ela deve ser testada certificada avaliada e depois leu finalizada ou em forma líquida ela é estocada nessa forma a partir desse dessa cepa vacinal fazemos uma amplificação dessa cepa fazemos passagens dessa cepa para obter um volume razoável de decepar vacinal e distribuído também em frascos ampolas ou tubos e aí nomeamos essa primeira passagem como banco de vírus semente a partir de uma ampola do banco de vírus semente produzimos o banco de vírus trabalho amplificamos mais e fazemos um número maior de ampolas

no banco vírus semente normalmente podemos produzir de 20 a 50 ampolas e no banco trabalho de 100 a 400 ampolas tudo é o ele utilizado na forma líquida guardado em baixas temperaturas aproximadamente menos 80 graus quando é na forma líquida na vermelha utilizada se guardar no freezer nos 20 a uma vez tendo a cepa vacinal produzido o banco estoque banco trabalho com todos os testes necessários vamos fazer o crescimento desse determinante antigénico que pode ser bactérias no como no caso de ficaria tétano pertussis vírus como o caso da raiva influenza ou recombinantes quando se tem

uma leveza da levedura uma bactéria outro microorganismo recombinante que vai expressar a proteína meses alvo em particular em forma de partículas semelhantes a vírus aqui é um exemplo de de levedura recombinante da hepatite b que expressa a proteína do vírus da hepatite b e ela tem a capacidade de se é desse rearranjar como uma partícula mas não tem material genético uma vez tendo os bancos vamos preparar inóculos fazer uma passagem seriadas em tubos ou em frascos mas menores passa para maiores ou até no fermentador ou quando é no caso de células de linhagem é feito

em culturas de e culturas em garrafas porque a célula pode aderir na superfície da garrafa a partir dos inóculos é que se vai no cultivo de produção no maior volume os inóculos eles podem começar com 10 ml partir pra 100 pra dá pra 10 litros para 50 litros aí se faria no fermentador para depois passar para o cultivo de produção que é que normalmente se faz em fermentadores de 500 litros mil litros 2 mil litros 5 mil litros ou em uma série de garrafas que substituiriam fermentador como no caso da influenza não não preparamos e

passagens de inóculos e nem o cultivo de produtos não é em o ovo então o inóculo a uma ampola do banco trabalho é diluída no volume conveniente inoculado diretamente no ovo o ovo embrionados de galinha embrionados e cada ovo seria como um fermentador então o vírus é inoculado dentro do ovo ele se replica amplifica e teremos um número suficiente de vírus para poder fazer a vacina depois o cultivo que pode demorar de de uma semana a 30 dias temos que processar o produto que foi fermentado que foi cultivado no ovo que foi cultivado nas células

então temos que fazer a separação da nota do nosso o antígeno né do determinantes antigênicos a nossa proteína alvo da matéria prima que foi utilizada seja o ovo seja a levedura seja bactéria então tem o processamento de separação separação das células às vezes utilizamos nas células como no caso da vacina pertussis o world e normalmente se utiliza a proteína é o sobrena da amt é o que separou o líquido que dôo no meio líquido de cultivo então separar célula eo líquido e o líquido é que contenha determinantes antigênicos podemos usar a equipamentos com membranas para

fazer separação da semana do líquido do sólido líquido ou centrífugas em que o material passa ele gira numa determinada rotação sedimento a parte sólida e libera parte líquida quando precisamos utilizar parte sólida é recolhida parte sólida quando precisamos utilizar parte líquida recolhimento é que colhemos a parte líquida como no caso das vacinas bacterianas o pertussis no caso quando é recolhida às células ela precisa ser de toxic ficada isto é ela tem que ser inativada então é colocado um produto normalmente formal day numa determinada consertar concentração espera-se um tempo de 30 31 é de 25 a

30 e poucos dias 35 dias pra essa de detoxificação e depois continuar o processo de processamento em outros casos depois que se separa a célula do do líquido e se vai utilizar células como no caso da hepatite em que é colhida levedura ela precisa ser rompida para liberar a nossa proteína é porque a levedura ela não rompe sozinha e libera a proteína da hepatite b no caso então precisa fazer uma desintegração rompê as células é assim também outras vacinas que são cultivadas em células de linhagem também precisa ser rompido e pode se usar um equipamento

de desintegração como esse da hepatite ou outros tipos de equipamento o volume de cultivo de produção é grande variando de 500 litros a mil litros 2 mil litros então é impossível a gente trabalhar com esse volume e tem equipamentos que concentra esse volume ele tira a mais a parte líquida e concentra a nossa proteína com outras impurezas que ainda possui nesse material então usa o podemos utilizar membranas cassetes de membrana ou ou cápsulas de membrana e pra pra volumes grandes volumes menores que aí pode fazer no sistema fechado então essa etapa ou e podemos também

trocar o tampão o líquido que contém o dt o a proteína aí chamamos de a filtração quando trocamos o líquido que contém a proteína por outro outra outro produto ea concentração do volume de 2 mil 3 mil 5 mil litros podemos concentrar para 100 litros para 50 litros para 200 litros dependendo da tecnologia desenvolvida após a etapa de de a filtração concentração teremos que fazer uma melhor purificação desse material as estratégias de purificação variam aqui nessa etapa também podemos usar ultra accent fugas são equipamentos que rodam a em velocidade alta de de 30 mil a

50 mil é rotações por minuto então material é colocado dentro da centrífuga ela fica em rotação elevada eo a proteína determinante antigénico vai para uma determinada faixa que a gente colhe e isso já foi estudado e temos o vírus purificado por ultracentrifugação normalmente se usa um gradiente de sal ou de açúcar que aí como uma mágica é o vírus ou a proteína vai naquela faixa específica de concentração de sal ou de açúcar outra metodologia que pode ser aplicada para essa purificação mais fina é a cromatografia em que se utiliza resinas eo material é passado por

essas enzimas as resinas funcionam como filtro e em determinada tempo sá é o 1o determinante antigénico é filtrado ea gente colhe em determinado tempo em outros tipos de cromatografia né é o mais simples é de cromatografia é de separação e que separa as proteínas por tamanho outras são em que há a proteína alvo se liga nessa resina e depois com uma lavagem com os o com um tampão especial à rede o determinante antigénico que grudou na resina ela se solta ea gente tem o material purificado depois de várias etapas de purificação e várias formas de

se purificar a de a filtração é uma forma de se purificar a outra centrifugação acrobata as cromatografia e aí tem um processo de filtração esterilizante às vezes nessas etapas são sistemas abertos que não são contínuos então precisamos fazer uma filtração esterilizante pra tirar remover os possíveis contaminantes que tem nesse produto a partir do momento em que fazemos a filtração esterilizante obtemos o produto concentrado é o concentrado do de seja lá da do vírus do da influenza ou o epa com a proteína da hepatite as toxinas df teria tétano ou a bactéria pertussis entre outras então

chamamos aqui de produto concentrado esse produto concentrado é que vai vai ser formulado envasado para obter mos a vacina são vários tipos de vacina é como vocês sabem a vacina viva atenuada como da febre amarela pólio sei bem o sarampo rubéola caxumba vacina de tipo inativado em que a toxina é inativada ou vírus inativado oa ou a bactéria inativada como no caso aqui da da vacina da coqueluche a vacina da gripe além de inativada vacina da gripe a e da gripe é fragmentada a vacina da raiva também é inativada pólio não aceita bem a outra

pólio ela também é inativada temos vacinas conjugadas como nem meningococo e mofo nos influenciam b vacinas a celulares no caso da difteria e tétano que são toxinas não têm a bactéria não tem a célula bactéria a coqueluche também agora tem a coqueluche a né e pertussis acelular vacinas recombinantes como hepatite b em que é feita através de levedura recombinante que expressa a proteína do vírus da hepatite b eo hpv também dominante a nova vacina em teste dengue também é recombinante e tem teste de vacinas de dna vacinas com outros vetores recombinantes que ainda estão em

estudo estudo aqui são alguns produtos do instituto butantan na vacina influenza dtp a dupla adulta vacina da hepatite b eo hpv entre outras agora eu vou falar um pouco sobre como já sabemos que o desenvolvimento demora muito tempo são várias etapas então pra vocês terem uma idéia vou mostrar como é a produção da uva de uma vacina no caso da vacina influenza a vacina influenza produzidas no instituto butantã o instituto butantan pertence à secretaria de estado da saúde e também soube a coordenadoria de ciência tecnologia e insumos estratégicos em saúde o laboratório de influenza nem

pertence ao serviço de virologia e nós trabalhamos praticamente com todos os departamentos da do institudo desde a diretoria a divisão de produção a garantia de qualidade controle de qualidade setor de formulação envase estoque e engenharias o rh também nos ajuda muito entre outros o nosso único cliente é o ministério da saúde toda a produção de vacinas e soros é entregue para o ministério da saúde a vacina de influenza ela é parte de uma transferência de tecnologia que o instituto butantan fez costa não ficou a ser da frança é uma vacina baseada em ovos embrionados de

galinha então ela é produzida em novos de embrionados de galinha aqui comparando com o desenvolvimento de uma vacina tivemos que desenvolver toda a a a parte de produção dessa vacina do instituto butantã e como exemplo de desenvolvimento de vacina então essas três primeiras etapas é o cultivo é recebemos os ovos de galinha embrionados inoculamos os ovos e fazemos a colheita de um líquido que tem dentro do ovo chamado de líquido alantóico então essa é a primeira parte do dedo de uma produção de vacina depois de depois da colheita vem a parte de de processamento e

etapas de purificação então temos a purificação que é por ultracentrifugação em um açúcar no gradiente de sacarose a fragmentação inativação viral para depois que fazemos a filtração esterilizante e temos o produto concentrado que no caso chamamos de suspensão monovalente concentrado para o vírus a a vacina da influenza é composta como vocês sabem de três cepas do vírus influenza a dois tipos neo h-1h h-1h 3 ea vírus influenza b então precisamos produzir as três cepas para depois começar a formulação e envase e depois da formulação envase é que temos a vacina nem nos frasquinhos é chamado

de vírus influência fragmentado inativado a produção da vacina influenza sazonal nem tão a gripe sazonal mas nos finais dos meses do do outono e com o pico no inverno então o butantan faz parte da rede mundial de vigilância da gripe da organização mundial da saúde a essa organização e seleciona as equipas que vão compor a vacina que nós vamos usar no nosso próximo inverno então o anúncio feito em setembro de cada ano no final de setembro então a nossa produção da vacina só pode começar após setembro possivelmente outubro porque temos que importar as cepas preparar

o banco trabalho e aí começará a produção a produção em forma de campanha porque temos que produzir três cepas então primeiro pro vimos uma cepa aí o todo o laboratório é limpo é descontaminado pra começar segunda cepa e depois começar a terceira se á então apenas um ea produção a da cepa se dá entre setembro e março ea formulação envase da vacina se começa em fevereiro aí tenha o envio para o ministério da saúde ministério da saúde distribui pra e ter a campanha da vacinação a partir de abril então é é demora mais ou menos

cinco a seis meses a produção da vacina para que ela tenha ali na prateleira na geladeira além dos postos de saúde para fazer o cultivo então o banco trabalho é diluído num volume conveniente e enoh e este ps e se essa diluição do banco trabalho é inoculado em ovos né a inoculação é feita automaticamente uma máquina e injeta automaticamente inóculo dentro do ovo na cavidade alantóico é o ovo de galinha embrionados entre embrião de 10 ou 11 dias então o ovo tem uma câmara de ar o o o local onde se aloja o embrião que

a gente chama de cavidade alantóico então vírus é depositado diretamente na cavidade e lan toca o vírus se replica dentro de células células do embrião células do ovo células da membrana do híbrido do ovo e depois de dois a três dias de incubação esses ovos são colocados em incubadoras concorrente com temperatura controlada aproximadamente 34 35 graus para que o vírus se replique e o embrião sobreviva né então depois de 23 dias de replicação viral né o vírus penetre nas células replica e é liberado no link do antológico a nossa produção é aproximadamente de 268 mil

ovos por dia e a a máquina de inocular inocula entre 36 e 40 mil ovos por ora então para inocular os os quase 300 mil ovos são necessários aproximadamente dez horas de trabalho ininterrupto depois da da incubação de 23 dias para que ocorra a replicação viral os ovos são resfriado para trocar acionar a morte do embrião a liberação de mais partículas virais e o sangue coagulado porque os ovos depois na colheita do líquido alantóico os ovos são cortados e se tiver o sangue aí vai atrapalhar na nossa na nossa na purificação então precisamos resfriar os

ovos os ovos são cortados numa máquina no topo do a nível da câmara de ar depois são invertidos e colhidos o colhido líquido alantóico nesse equipamento cada ovo da aproximadamente 10 11 ml de líquido antológico e o volume final de do cultivo de produção é aproximadamente três mil litros então cada ovo funciona como fermentador temos que escolher não ovo por ovo mas é automático na década 80 e 86 ovos aquele que tem uma bandeja então no total obtemos mais ou menos 3 mil litros que equivaleriam a fermentação de 3 mil litros depois da colheita dos

ovos do líquido no tópico né esse líquido é misturado no tampão e ele é centrifugado para tirar a contaminantes maiores como algum restinho que tenha de o embrião pedacinhos do tecido do embrião e células as células vermelhas né as hemácias no sangue coagulado então esse equipamento a centrífuga ela tira os as impurezas maiores como são 3 mil 4 mil litros de material concentramos né como etapa seguinte da da purificação concentramos para um volume aproximado lado de 200 e 250 litros num fio num sistema de filtração tangencial em que esse filtro tem um ponto de corte

então os materiais a acima desse ponto de corte ficam retidos e o líquido é descartado e concentrando a nossa proteína com alguns outros outras impurezas do ovo que pode conter depois da etapa da concentração com um volume de 200 300 litros é mais fácil manipular aí fazemos uma purificação por ultracentrifugação utilizamos um gradiente de sacarose colocamos o material dentro dentro do da centrífuga ele vai ficar rodando a 35 40 35 40 mil rotações por minuto e o gradiente de sacarose forma faixas de concentrações de sacarose e o vírus vai exatamente naquela concentração que ele precisa

ir numa concentração aproximada entre 30 a 40 por cento de sacarose é onde a gente sabe que o vírus está e recolhemos essa porção desse gradiente de sacarose ou de contém as partículas virais os três mil litros de líquido alantóico ou 260 mil ovos depois da outra centrifugação depois da purificação obtemos num volume final só de 2 litros então aqui tem um vírus muito concentrado que cada gotinha daria pra fazer milhares de vacina milhares de doses de vacina então essa etapa é a etapa mais cara etapa mais sensível onde uma gotinha do material andaria várias

doses de vacina depois da concentração purificação do vírus em 2 litros no gradiente de sacarose porque há ali naqueles dois litros tem praticamente apenas os vírus influenza esse material é diluído num volume com o v gente entre 10 a 25 30 litros e fragmentado fragmentado o vírus está inteiro aí no momento que colocamos um detergente o vírus fragmento esse detergente rompe a camada lipídica e temos o vírus fragmentado por isso que a vacina chama também vacina da gripe fragmentada e depois da fragmentação fazemos uma pequena limpeza também para tirar os pedaços muito grandes do vírus

e diluímos novamente pra o volume conveniente pra gente inativá porque pode ser que nem os 100% do vírus seja fragmentado então para garantir que tudo todos os vírus os fragmentado sejá são inativos mas se porventura ficou algum vírus e na inteiro ele vai ser ativado pelo formaldeído essa etapa de fragmentação e na ativação demora mais ou menos cinco dias né obtemos um volume grande né mais ou menos 40 70 litros dependendo da cepa tem cepa de influenza h1 ou cerca de h3o a cepa b que rende de maneiras variadas depois de obter a e se

esse material fragmentado inativado temos a suspensão monovalente fazemos uma filtração exteriorizam ante e membranas de 0 22 micra que vai tirar algum possível contaminante quem amostragem pelo controle de qualidade eo material a suspensão monovalente estocamos em bombonas e cada lote cada 268 mil ovos por dia podemos obter de 80 150 litros de suspensão novamente concentrada aqui também tem os testes cada etapa tem os testes de controle de qualidade aqui são os testes de controle de qualidade final o prazo para o término dos controles aproximadamente 15 dias então a vacina é do cultivo de produção da

inoculação nos ovos até a purificação até a filtração esterilizante a vacina é fiel ou a suspensão monovalente demora mais ou menos entre 10 a 15 dias esse processo de produção mas os com 15 dias de controle de qualidade então seria teoricamente um lote de monovalente e dura por trindade em 30 dias mas como temos a produção todos os dias né época de campanha de produção todos os dias recebemos ovos seja sábado domingo feriado então por mês produzimos 30 lotes de monovalente precisamos produzir três cepas então a cada dois meses mudamos de cepa em cada campanha

utilizamos aproximadamente 50 milhões de ovos 50 ou a 60 quase dependendo da do rendimento podemos utilizar até 60 milhões de cepa cada ovo dizemos que dá uma dose de vacina trivalente quando falamos em suspensão monovalente cada ovo daria três doses de vacina monovalente mas quando é a vacina final trivalente um ovo corresponde a uma dose de vacina então como produzimos para o ministério aproximadamente 40 50 milhões de doses de vacina utilizamos também o mesmo número de jogos depois de produzir as três cepas mais ou menos no mês de fevereiro enviamos os as bombonas de monovalente

das três cepas porque aí já teremos as três cepas produzidas ea terceira cpi é o início da produção a e ao mesmo tempo que se faz à formulação envase continuamos produzindo a terceira cepa e então esses três monovalentes são enviados por cento para a seção de formulação que vai misturar as três cepas diluir um volume conveniente com um tampão para que cada meio ml correspondem a uma dose de vacina cada dose de vacina tem 15 microgramas de cada tipo de influenza 15 microgramas de h1 15 microgramas de h3 e 15 microgramas de b então faz

se faz a formulação aguarda-se um tempo o três a cinco dias para que se faça testes de controle de qualidade mais específicos e é esse material formulado é enviado o processo para a seção de envase que vai colocar essa essa vacina a granel é bruta nos frascos nos frascos multidoses então aqui é a máquina de envase colocando ejetando né ô ô ô a vacina influenza em cada frasco depois cada frasquinho é colocada tampas de alumínio chamamos de regravação tem também a inspeção visual que que todos os frascos passam por equipamento e descarta aqueles que por

acaso possam conter algum fiapo alguma partícula e depois vem a etapa da rotulagem né isso é feito a ênfase é um dia só a formulação cada lote de aproximadamente 1 milhão de doses de vacina o envase também é feito praticamente num dia só às vezes acontece algum problema com os equipamentos então é deixado para o dia seguinte mas é uma jornada de de 8 a 10 horas por dia háháhá o laboratório de influência trabalha 24 horas porque tem um processo que começa às às cinco horas da tarde vai acabar 5 horas da manhã do dia

seguinte na no setor de envase também em época de campanha eles trabalham no turno diferenciado pra poder dar tempo de entregar no prazo para o ministério da saúde depois da rotulagem tem para tratamento é colocar os frascos multidoses de 10 dó cada frasco nos bercinhos e colocar a na caixa tem novamente os controles de qualidade que demora pelo menos 15 dias e tem toda a documentação a ser preparada para poder entregar para o ministério da saúde então aqui já é o produto final né com acondicionamento e e depois de um de depois de uma quarentena

o produto é empregado por ministério da saúde para a campanha de vacinação em abril é isso que eu tinha que falar sobre desenvolvimento e produção de vacina agradeço mais uma vez muito obrigada pelo convite é um prazer e parabéns à comissão