Seminário Prof Dr Arnon Dias Jurberg

Olá, pessoal. É um prazer tá aqui, né? Foi uma honra ter recebido esse convite para poder falar um pouquinho com vocês sobre técnicas de edição gênica, em especial voltado pro pro Murganho, né, pro Camondongo. Ah, o meu nome é Arnon Jurber, eu sou PhD, PhD justamente em biologia desenvolvimento no Instituto Gubank. Morei 5 anos em Portugal. E aí poder falar hoje para vocês eh é é um uma grande alegria ah de trazer muito do Que eu aprendi aí quando eu tava ah no meu doutoramento. Então, só para vocês me conhecerem um pouquinho, eu sou biólogo,

formado no Brasil, na no Instituto de Biologia na Universidade Federal do Rio de Janeiro. E aí em seguida eu fiz um mestrado em biologia celular e molecular no na Fundação Osvaldo Cruz, uma uma importante fundação associada ao estudo de doenças, né, principalmente doenças ah infecciosas, mas hoje em dia esse perfil Já tá mudando. E em seguida eu eu me mudei para Portugal, fui fazer um doutorado no IGC ah com o Dr. Moisés Malo, né? Tá aqui a imagem dele, o pessoal na ECO, no laboratório, eu aqui no cantinho. Ah, e aí ah, trabalhei com desenvolvimento

embrionário, né, de de Murgan, de Camundongo. E em seguida eu retornei pro Brasil para fazer um pós-doutorado em imunologia, ah, também atuando na Fiocruz. E aí durante esse Pós-doutorado, eu comecei a atuar como professor. Ah, e aí a primeira, né, normalmente a primeira etapa é você atuar como professor substituto ah no curso de biologia celular e do desenvolvimento na também na Universidade Federal do Rio de Janeiro, agora em outro instituto, o Instituto de Ciências Biomédicas. E e depois de alguns anos fazendo a a enfim, né, o esse pós-doutorado na Fio Cruz, eu fiz uma especialização

no Marine Biologic Laboratório em Usle. Imagino que alguns já devem ter ouvido falar. Ah, e a em seguida eu comecei um novo pós-doutorado na FERJ ah, justamente em biologia solares aumento, agora já trabalhando com o zebra fish. E eu ainda fiz também um MBA em ciência de dados e inteligência de negócios numa universidade aqui do do Rio de Janeiro chamada PUC, né, Pontifícia Universidade Católica. E nos últimos anos eu eu tenho Atuado como professor de histologia e embriologia na no curso de medicina da Universidade eh Estácio de Sá. Ah, e recentemente comecei uma iniciativa eh

de empreendendoismo, ah, fundando uma empresa justamente para produção de animais geneticamente modificados chamado Altera Genetics. Então, esse é um é um breve resumo, né, da minha trajetória, da minha formação, ah, e que me possibilita poder fazer essa conversa com vocês, ah, sobre a produção de Animais geneticamente modificados. Então aqui eu eu trago para vocês ah conceitos que eu julgo importantes justamente porque alguns grupos consideram ah transgênico todo o animal eh geneticamente modificado e outros grupos falam que não, que os animais transgênicos são aqueles que receberam a a elementos genéticos exógenos, né, que vieram de outra

espécie. Ah, normalmente, né? Ah, e e essa introdução de de elemento genético, Ele com vocês, a gente vai detalhar isso um pouquinho. Ela tem as suas particularidades e é um pouco diferente das técnicas que são utilizadas para gerar o knockout, né? E aí eu botei noockout e all ah metodologicamente a gente vai ter também eh outras alterações gênicas como no que no fundo elas são baseadas em métodos muito similares. Então, a minha ideia é discutir com vocês agora, né, nessa próxima hora, 1 hora e meia, Eh, a [Música] a os métodos clássicos para depois a

gente falar, né? Imagino que todo mundo já conheça, já já tenha discutido um um bocado aí uma tecnologia já agora não tão recente, né? tá fazendo, fez 10 anos que ela tá eh sendo utilizada no laboratório, mais de 10 anos já, que é o Crisper. Então, quando eu falo eh em em knockout e no e similares, eu tô falando de Alterações ah no cromossômicas, né, no nos losses endógenos e e isso envolve um direcionamento ah daquela modificação que que precisa ser feito, tá bom? Então, ah, de um modo geral, para ficar bem claro, quando eu

falar de transgênico, eu tô falando de introdução de elementos genéticos, essa introdução pode ser aleatória. E quando eu tô falando de modifica eh knockout e similares, eu tô falando de modificações que são direcionadas, né, o target a Modifications. Tudo bem? Então, vamos lá. Que que a gente vai discutir agora? Ah, para a gente nivelar e deixar todo mundo, né, no no no mesmo nível, o mesmo conhecimento, eu vou fazer uma breve discussão muito muito rápida, muito simples sobre o que que é um gênio. E por que que isso é importante? Ah, porque a gente vai

estudar a função do gene. Então, a gente precisa saber exatamente o que que é um gênio para depois discutir como é que a gente pode Eh estudar sua função. E aí, como é que a gente visualiza a expressão gênica? Tem várias técnicas, eu vou falar só de algumas, tá? Eh, a ideia aqui é ser bem introdutória nesses dois pontos iniciais e e aí depois a gente vai dar um mergulho fundo, né, a um deep di para falar de manipulação gênica. E aí dentro dessa manipulação gênica, a gente precisa entregar as construções, né? Então essa hoje

talvez seja a grande eh o grande desafio de como poder alcançar O maior número de células. Isso quando a gente fala em em em animais adultos, né? Ah, e basicamente aqui tem uma série de de técnicas, eu vou discutir algumas com vocês, né, que é a transênese clássica, a recombinação homóloga em células tronco, em células estaminais, são são duas abordagens eh ah consolidadas há há 40 anos, né, e que a gente ainda usa hoje a em dia pela sua pela, né, pelo poder que elas têm de estudar. Mas claro, recentemente a gente tem ah uma

Série de alternativas, né? Vocês já devem ter ou falar de Talen. Hoje em dia o Talen tá menos usado e a gente usa muito a a Crispras variações. Então a essa a ideia de de fazer essa conversa, né, de de levar isso para vocês. Beleza? Então o que que é um gênio? A gente tá vendo aqui um, né, uma fita dupla de DNA. Então, a gente tem, né, enfim, várias definições de do que que é um gênio. Uma definição que é relativamente simples e E de ampla utilização, é que um gênio é uma sequência de

nucleotídio que é localizável na no cromossomo, tá? E que essa sequência ela vai ser herdada de pai pro filho, da célula mãe pra célula filha. Ah, óbvio que hoje em dia a gente conhece eh outras eh definições, definições, né? Classicamente, antigamente o pessoal falava que um gênio ia eventualmente codificar uma proteína a ou aí depois virou uma ou mais proteínas. E hoje em dia a gente Tem a o conhecimento que nem sempre a gente vai ter uma tradução para uma proteína. a gente pode ter elementos que não são traduzidos, tá? Então eu não vou entrar

no mérito dessa discussão com vocês, mas é importante vocês terem isso em mente, claro. Ah, mas pro nossa discussão, paraa discussão de edição gênica, de estudo de função de gene, é importante que a gente saiba que ah primeiro, né, os genes são são sequências localizáveis. Isso hoje em Dia fica muito mais fácil da gente acessar a partir das técnicas de sequenciamento, né? Eh, começou com sequenciamento hã bem manual e depois foi pro sequenciamento Zanger. Hoje em dia a gente tem várias tecnologias de sequenciamento de próxima geração, né, Next Generation Sequency. E com isso a gente

consegue dizer exatamente que o gene ah enfim a está localizado no cromossomo ah um, tá? Eh, e aí quando a gente olha para para essa sequência Localizável, a gente consegue perceber que ele contém várias regiões. Então, a primeira região que eu gostaria de chamar a atenção para vocês, a gente chama de exon, são sequências de nucleotídeos que vão ser mantidas durante o processamento do RNA. Então, só relembrando, né, de de forma bastante eh simplificada, a gente tem a o dogma central da biologia molecular, que o DNA vai ser transcrito em RNA, eh, RNA Mensageiro, e,

e eventualmente esse RNA mensageiro vai ser traduzido pra proteína. No caso, a gente, né, a gente sabe hoje que esse RNA eh mensageiro, ele é um pré-RNA, ele sofre um um uma edição, um spling, paraa remoção de algumas sequências. que estão localizadas aqui entres. Então, essas sequências são chamadas de de intron. Elas são removidas e aí a gente vai ter um RNA mensageiro mais curtinho, né? Que caso a gente, enfim, e Trabalhe com uma enzima de de transição reversa, esse esse RNA mensageiro processado, ele vai virar um CDNA, né? O DNA complementar, vocês já devem

ter ouvido falar. Ah, mas nesse caso aqui a gente vai ter então eh eh essa região sendo eventualmente eh traduzida pelos pelos ribossomos, tá? OK? E aí quando a gente olha para esse RNA mensageiro, a gente consegue identificar regiões, essas regiões azul mais clarinhas que tão no RNA mensageiro, mas que elas não São traduzidas. Então a gente vai chamar de untranslated region, né? UTR. Se elas estão localizadas na parte eh eh anterior, né, no inicial a do genas estão depois do do stop, a gente vai chamar de três linha TR, OK? E aí, ah, quando

e como e aonde a gente sabe que esses genes vão ser expressos? A gente precisa de algumas regiões reguladoras. Então, todas essas regiões que estão eh listadas aqui embaixo entram nessa classe de esse grupo, né, De reuniões de regiões reguladoras. A, uma das principais a gente chama de promotor. Então, o promotor basicamente é uma região reguladora que vai est envolvida no processo de ativação e repressão daquele gene. E aí é muito importante a gente ter esse conceito bastante claro que vai ser o promotor que vai, entre aspas, dizer pra gente quando e onde aquele gênio

você expressa, tá? Eh, e aí eu posso ter promotores que são eh constitutivos, Eles estão sempre ativos. Eu posso ter promotores que são induzíveis, então dependendo do estímulo, ele passa a ser ativado. E obviamente eu posso ter promotores que vão ser reprimidos, né? dependendo do estímulo, ele ele ele vai levar a inativação, vai levar a uma repressão da expressão daquele gênio. E aí eu tenho outras regiões reguladoras, né, aqui o erran, insulators e sequências barreiras que são muito importantes para fazer o o a a regulação Fina do processo de de, né, do desse processo todo

de expressão, tá bom? A gente vai falar muito pouco, né, de erran, insulators e e sequência barreira, mas basicamente aqui a gente consegue ver ah breves definições delas. O, o que é muito importante pra gente nesse momento é lembrar que a gente tem uma sequência promotora, a gente vai ter sequências que não são traduzidas, a gente tem sequências que são mantidas, Eventualmente vão ser traduzidas, né, os exonos, sequências que são removidas, né, os introns. E obviamente tem o neon stock codon e a gente tem depois uma uma cauda, né, de e três linhas TR que

também não é traduzido, tá OK? E aí, a ideia desse rá é mostrar para vocês algumas das aplicações que a gente usa para estudar função de genes e estudar localização, distribuição. Eh, uma delas eh muito clássica, né, no estudo da biologia desenvolvimento, a Gente chama de ah hibridização em cito, é whole mount, né, cito hibridization. E a gente tá vendo aqui, por exemplo, a o embrião de de, né, camundongos a em torno aí de 10 dias e meio desenvolvimento embolário. A gente consegue ver que tem genes que estão expressos só na região da caudda e

e, né, do high limb, for limb aqui, mas que não estão expressos no restante do tronco ou mesmo na cabeça, tá bom? Aqui a gente tá vendo, né, genes rox rox a 10, C10 e e D10. E aí, por exemplo, o que que é interessante? Quando eu produzo um animal transgênico, eu consigo ver que o ganho de função, no caso aqui desse desse fator de transcrição, ele consegue mudar o domínio de expressão eh do nosso genial. Então isso dá a a uma indicação direta de que essa molécula aqui que tá sendo hiper expressa ah numa

região que normalmente ela não é expressa, né, ou tá sendo expressa numa região que ela é Expressa, mas numa quantidade muito maior, ela vai, por exemplo, nesse caso aqui, eh eh empurrar para trás, né, inibir o a a ativação, a expressão dos rocks ah do grupo 10, por exemplo, tá OK? Então eu consigo utilizar a ilização cito para ver esse padrão de expressão. Aqui tá basicamente uma breve descrição de como é que ela funciona. Então eu uso uma sonda de RNA eh antissenso, né? Antisenso por quê? Porque a gente precisa daquela complementariedade de Bases de

Watson Creek para fazer o reconhecimento específico. E aí essa sonda vai ter marcações ah de dig, né, que vão ser reconhecidas por anticorpos. E aí esse anticorpo, ele tá conjugado a uma enzima, né, a uma fosfatose alcalina que reage com substrato e vai gerar cor, no caso aqui uma cor azulada, tá? Então, repara que é um um procedimento relativamente eh simples. No caso, o protocolo de ilização cito, enfim, pode demorar aí Até uns 5 dias mais ou menos, justamente para gente lavar as sondas que não ficaram ligadas e remover eh eh os anticorpos que tiveram

algum tipo de ligação em específico pra gente poder ter uma marcação dessa aqui bem bonitinha, eh, e específica aqui paraas regiões, né? aqui coração, por exemplo, a a a da onde aquele gente tá sendo expresso, tá bom? Claro que o existem, enfim, variações de abilização cito com Fluorescência, a algumas outras sondas, eh, que podem dar até um perfil, né, de de de quantificação. Então, eh, são são variações muito interessantes pra gente estudar a a localização, né, a distribuição daquele gene de interesse para vocês. E aqui né, o outro exemplo é que a gente pode usar

ah estratégias. No caso aqui, tanto essa linha de baixo quanto essa linha aqui de baixo, a gente tá usando Transgenia para ver função. Então quando eu faço uma hiperxpressão ah do Oct 4 ah sob o controle de um promotor, promotor do CDX Tol, eu vou causar essa mudança no padrão de localização do Genesis Roxy, né, do grupo 10, quando eu faço de um outro gênor, tá pessoal? Quando eu faço um outro gene, né, o 3a, eu faço um um um truncation, né, eu eu eu bloqueio a extensão axial do do desenvolvimento dos vertebrados, aí gerando

aqui uma massa De células ectópicas. Mas o que é mais interessante aqui, gente, é, repara que a gente tem, né, o for limb, o high limb, mas a gente não tem o tronco que a gente, né, deveria observar entre os nossos braços e pernas, como a gente observa aqui no animal não transgênico, no animal white typic. E aí, é claro que eu posso fazer, enfim, variações de construções. Então, por exemplo, aqui eu tô vendo um promotor de um gên chamado Arlet One, ah, que tá dirigindo A expressão de um gên reporter chamado beta e galactos.

E aí, se eu fizer mutações específicas nesse promotor para Binance de fatores de transção, eu consigo eh eh identificar que ele deixa de ser expresso na sua região original. Então, o que que a gente tá vendo aqui nesse cantinho aqui que é que é a parte de eh justamente que a gente pode usar a transacterizar eh sequências reguladoras? Aqui é o é a expressão por ilização em cito. A gente vê, tá pegando Aqui eh o mesodermo da placa lateral. Quando a gente faz a construção Y type, vamos dizer assim, eh, a gente consegue mimetizar esse

padrão de expressão, né, com com o repórter, o que que é um controle importante, um controle bacana. E aí quando eu faço essas mutações nessas bolinhas vermelhas que a gente tá vendo aqui e alguns bindites, ah, nesse caso aqui de de smad, a gente vê que a o meu repórter não é mais expresso e a gente Não vai ter mais cor, tá OK? Então, ah, como é que a gente faz para chegar nessas aplicações, né? A gente precisa de alguma forma fazer a manipulação do do DNA, como é que eh essa manipulação pode ser feita

em laboratório? E aí para isso, e óbvio que, enfim, tem várias técnicas, eu não vou me aprofundar muito em todas elas, isso seria impraticável, mas de modo geral a gente precisa eh Eh levar, né, manipular esse DNA. E isso é feito com uma molécula que a gente chama de plasmíd. É uma molécula que é encontrada em bactérias, que é basicamente um DNA fita dupla circular. ele é ele é estável. Então, se aquela linhagem de bactéria eh normalmente apresenta 50 cópias, esse número ele não vai ter grandes alterações. Ele pode ter alteração pequena ou outra, mas

ele vai ficar nessa ordem de grandeza. Eh, o tamanho dele também é variável, mas fica Aí na faixa de de 1 KB a 200 KB, o que é já é enorme, né? Então, de um modo geral, a gente trabalha em torno aí de 5, 7, quando muito 10, 12 cab. Ah, eh, tamanhos maiores que esses geram alguma dificuldade, né, de de manipulação, de sucesso de colagem. E, e aqui tá um pouquinho encoberto, mas basicamente a gente tá falando que os plimídios eles têm a capacidade de conferir a um tipo de de vantagem adaptativa. Por exemplo,

o que que eu Quero dizer com isso? Eh, normalmente os plasmídos carregam genes de resistência antibiótico. Eh, lembrando, né, que eu tô falando de de de um elemento que foi isolado de bactéria. Então, se eu tenho uma bactéria que é resistente a ampilina, esse gênicilina ele fica presente normalmente, né, no no es plasmíd. E aí eu posso trocar gen de resistência, eu posso usar canamicina, clorofenicol, enfim, tem uma série de exemplos. O que é bacana é que a Replicação desse plídio, é independente do da replicação do DNA bacteriano, é claro, né, um DNA circular extracromossômio

e ele pode ser dado independentemente, tá? ele não, ele não necessariamente ele vai ter eh um padrão de herança associado ao cromossomo. Então, com isso a gente consegue utilizar a virtualmente qualquer sequência de DNA, né? Lembra que eu falei de de promotores, falei ah, né, dos genes, né, das das sequências Codificantes, enfim. Eh, só que pra gente fazer essa manipulação é necessário ah colocar esses elementos na ordem que a gente precisa e aí fazer isso a gente chama de clonagem molecular. Ah, e basicamente o que que é a clonagem molecular? É quando a gente corta

e cola ah na sequência que a gente quer e na ordem, né, que a gente quer essas essas sequências específicas. É basicamente um control X, um control V. ah, que a gente usa tanto no computador. Então, eu trouxe aqui um exemplo para vocês. Eu tenho um plasmídio doador com essa sequência verde e eu quero colocar essa sequência verde nesse plasmídeo receptor. Nesse caso aqui, cada uma dessas palavrinhas estão aqui indicam o que a gente chama de enzimas de restrição. São pequenas sequências palindrômicas de DNA que são reconhecidas por por nucleares, né? nucleares e essas enzimas

de restrição foram isoladas de Bactérias. Então aqui, por exemplo, a gente temericha. Ah, e aí, né, dependendo da espécie que ela veio, a gente vai ter essa essas abreviações aqui. E o que que é importante é que elas são específicas, tá? Então, a a sequência reconhecida pela enzima show um, ela vai cortar, ela só vai ser cortada pela show um, essencialmente pela show um pode ter uma outra, enfim. a enzima que tem um corte similar, mas de modo geral a show um não Corta a sequência alvo de R1, tá? E isso traz pra gente direcionalidade

na clonagem. Só que nesse nesse exemplo que eu trouxe para vocês, a gente não consegue identificar eh enzimas de restrição nessa região verde, né, flanqueando, é, tanto no início quanto no final dessa região verde. E aí o que que a gente pode fazer? a gente pode usar a uma outra técnica, né, a reação em cadeia da polimerase, né, o famoso PCR para com primeres específicos e e Introduzir a sequência que vai ser cortada tanto pela EC R1 quanto por uma outra enzima aqui chamada Note 1. São enzimas que estão presentes aqui no meu ah plasmídio

receptor. Então, ao final desse PCR, né, sendo um PCR bem-sucedido, agora eu vou ter eh ampli, vou ter fragmentos de de DNA que foram flanqueados com o o local que vai ser reconhecido pela nuclease, né, Eco R1 e aqui o outro local que vai ser reconhecido pela enzima norte R1. E aí Com isso a gente faz uma digestão, né, produzindo pontas ah ah coesivas, né? Então a gente chama essa clonagem de clonagem direcional. a gente tem algumas enzimas de restrição que fazem um corte cego, né? E aí a gente não tem essas pontinhas que vão

fazer essa direcionalidade. E aí, basicamente, o nosso amplio, né, o nosso nosso DNA de interesse, ele pode entrar nas duas orientações e isso vai trazer uma complexidade eh maior para fazer a Identificação de qual delas foi a orientação correta, tá? Mas nesse caso, né, eu trouxe para vocês o caso mais simples. Então aqui a gente viu o corte com eco R1 e note e note 1. Aqui também foi feito esse corte. Então repara que show um tá nesse cantinho daqui, não tá representado. Eh, note 1 tá aqui, mas a enzima rende tr ela foi perdida

porque ela tá justamente entre as duas, né, enzimas que a gente tá vendo aqui, tá OK? E aí, uma vez que a gente tem essas Essas esses dois elementos já cortados, né, linearizados, que a gente chama, a gente consegue agora fazer uma reação específica de ligação, que é baseada em enzimas estão associadas com a a síntese de DNA, né? Então aqui a gente vai usar uma enzima chamada eh T4 DNA gaze. E aí no final, né, correndo tudo bem, a gente vai ter agora um novo plasmídio, né, um plasmíio recombinante que ele tem, ó, show

1 e e R1 do plasmídio receptor. Ah, aí o Eco R1, né, ele foi Reconstituído por causa dessa interação eco R1 do do ampli do PCR com o Eco R1 aqui que foi cortado. Agora a gente tem a sequência verde que originalmente não existia, né, no plasmídio inicial. E no final a gente tem o note 1 também que foi reconstituído quando essa ligação foi bem sucedida. E essa é uma etapa muito importante, tá pessoal? Se a gente fizer alguma coisa aqui que não foi bem caracterizada ou ou que teve algum tipo de erro, tudo que

vier depois não vai tá Legal. Então, a gente precisa ter muita certeza que essa clonagem molecular foi bem-sucedida. Como é que a gente faz isso? A gente tem estratégias ah de screen baseadas em enzimas de restrição. Então, imagina que aqui tem uma outra enzima de restrição, vamos dizer, enfim, SPE1, né? SP1, ah, que corta aqui no no verdinho, mas não vai cortar se o plasmídio tiver vazio. Claro que a gente consegue fazendo um gel de de agarode, né, uma eletrofluorese em gel de Agarose, a gente vai conseguir ver que a entrada desse fragmento verde vai

aumentar o tamanho total do plasmídio. Então, mudanças no tamanho são importantes, são essenciais pra gente fazer esse screening. Eu posso usar a PCR também para fazer screening de sequências, né, de clonagens corretas. A gente normalmente chama isso aí de colony PCR, né, PCR de colônia. E e é óbvio que a etapa final, né, se você quiser eh ter 100%, né, 100% Nunca, mas assim, né, uma certeza maior de que tá tudo certinho, você pode sequenciar esse polarmídio ah recém sintetizado. E aí, uma vez que tá tudo certo com o seu plasmídio, né, na verdade, antes

da gente falar sobre isso, eh, aqui eu eu fiz uma pequena lista com com cinco pontos, ah, que são relevantes pra gente ter uma clonagem bem sucedida. clonagens de um modo geral são bem, elas são essenciais, né? Isso tem que falar muito muito claro para Vocês. Eh, e elas, de um modo geral elas deveriam ser simples, mas coisas estranhas acontecem durante a clonagem e a gente pode ter algum tipo de recombinação maluca que a gente precisa verificar se tá tudo bem, tá? Eh, então, para que a gente tenha certeza de que a gente tá começando

bem, né? Começando, o brasileiro fala de começando com pé direito, a gente tem que escolher os plasmídios adequados. São os plamídos que têm os nossos elementos de Interesse, que a gente vai querer, né, fazer o corte cola e botar na na ordem certa. a gente tem que escolher os locais de restrição adequados justamente para poder dar para facilitar a nossa vida e dar essa direcionalidade. As condições ótimas de ligação normalmente vem junto com a enzima quando a gente compra, né, todas as orientações específicas, né, de temperatura, concentração, volume, isso, isso relativamente simples, tá? Eh, a

Cepa de bactéria é muito importante pra gente ter a a entrada desse plasmídio recente sintetizado numa bactéria que possa produzir grandes cópias desse plídio. E aí depois a gente vai fazer o isolamento, né, o que a gente chama de mini prep, mid prep ou max prep, dependendo da quantidade. E aí, claro, a gente precisa de uma estratégia eh muito clara, né, muito muito bem pensada para fazer a identificação de quais colônias foram positivas, tá bom? Então, como é Que a gente faz a uma vez que eu tenho a clonagem ah, né, desse parmídio, depois que

eu confirmei que que a clonagem correu eh direitinho, como é que eu, na verdade, como é que eu vou saber eh fazer uma pequena correção, gente? Eh, uma vez que eu faço todo esse processo de clonagem molecular, eu vou ter uma mistura de plasmídeos no insolução. Alguns que vão ter vão estar corretos, outros que talvez não estejam. Eles podem estar vazio, eu posso ter Até, enfim, posso ter alguma recomendação maluca e ter duas cópias. Eh, dependendo da estratégia, eu posso ter orientações trocadas, tá? Eh, como é que eu sei, como é que eu consigo selecionar

aqueles parmídios que estão corretos e que eu vou poder usar nas etapas subsequentes? a gente vai pegar a aquela solução de plasmídio recombinante, né, que veio da ligação e pega o que a gente chama de bactérias competentes. Então, tem várias Estratégias, algumas são químicas, outras eh usam, né, tratamentos prévios ah com diferentes tampões para pra gente dar aí pode ser choque térmico, pode ser pode ser choque elétrico, tá? Eh, mas basicamente a ideia é criar poros temporários na membrana da bactéria para permitir que esse plasmídio entre ah no seu citoplasma, tá bom? E aí uma

vez que esse plasmídio entra no citoplasma, algumas bactérias vão receber o Plasmídio e outras não vão. A gente cresce esse pool de bactérias no meio ah rico com o antibiótico. Por quê? Porque aqui a gente sabe, né, que vai ter um um geno de resistência antibiótico. Então só vão crescer as bactérias que receberam aquele plasmídio de interesse. As outras por acaso ficaram vazias, vão vão morrer. Então agora eu vou ter uma quantidade grande eh eh de de células bacterianas com várias cópias daquele plasmídio. Lembrando que eu posso ter na Orientação certa, na orientação errada, posso

ter eventualmente, dependendo da estratégia, posso ter até mais de um número de mais de um número daquele daquele elemento, né, que que eu fiz o corte cola. E aí a gente precisa fazer essa seleção, tá? Então a gente faz essa seleção ah, como eu mencionei anteriormente, né, com com uma purificação de mini prep, mid prep ou max prep. E aí a gente faz a a o screening com enzimas de estrição ou faz O screening com PCR de colônia e eventualmente faz o seu conheciamento. Então uma vez que a gente fez tudo isso, conseguiu identificar que

a nossa clonagem foi bem-sucedida, a gente tem uma boa concentração de DNA para para enfim pro pra continuação ah do projeto. Agora a gente precisa eh pegar esse DNA e entregar eh pro nosso pro nosso organismo ou pra nossa célula, tá? Então a a pergunta que a gente vai tentar responder agora é: "Como é que eu posso Fazer a entrega dessa construção desse desse DNA eh pra minha célula, desse desse plasmídio?" Aí depende depende do organismo, depende se tá trabalhando com célula, se você tiver trabalhando com animais, pode, né? Eh, você pode fazer de um

jeito para peixe, de um outro jeito para para camundongo, eh, enfim, você pode fazer de jeitos diferentes para tipos de celas diferentes. Isso isso muda bastante, tá? E aí eu trouxe para vocês alguns exemplos. O primeiro exemplo que a gente usa no laboratório, né, e que foi consolidado já, enfim, há 30, 40 anos, a gente chama de microinjeção. E aí eu tenho basicamente dois sistemas. um sistema para cá mundo longo. Ah, que vocês conseguem reparar bem aqui. Eu tenho um microscópio invertido, dois joysticks, né, um de cada lado. Posso ter ou não um monitor ah

para enfim para compartilhar o que eu tô vendo eh Através de uma câmera com outras pessoas. E basicamente de um lado aqui eu tenho uma pipeta de vidro muito fininha, tá? uma holding pipet e do outro lado eu vou ter uma agulha de vidro muito muito muito fininha porque ela vai tá injetando, enfim, ela pode injetar DNA ou dependendo da situação, ela pode injetar até e células células modificadas, tá bom? Mas ainda assim são são e agulhas muito finas. E isso é feito no microscópio. Por quê? No Microscópio invertido. Por quê? Porque o embrião de

cundongo é muito pequeno, tá? Quando eu venho aqui pro lado direito, eu tô vendo, né, no no peixe, no zebra fixe, que eu não preciso usar o microscópio, eu posso usar um estereo microscópio, eu posso usar uma lupa. E isso tem a ver a com o tamanho com o tamanho do embrião. Então, o o embrião de de zebrafish é muito maior do que o embrião de camundonga, é sete vezes maior do que O embrião de camundong, tá? Todo o resto aqui é muito similar, né? Eu tenho uma bomba de de ar, né, com pressão. Eu

tenho aqui a uma agulha. No caso, eu não preciso, nesse nesse caso específico, eu não preciso de pipeta para segurar os embrones. Eles são muito grandes, eles ficam no fundo. E aí você vem com uma agulha também muito fininha e faz as injeções. É, muita gente faz essa injeção na mão. O embl tão grande que você consegue, né, prendendo a Respiração, tendo um pouquinho de paciência, de calma, tranquilidade, você vai lá e e consegue injetar o DNA. E aí tem um pedalzinho aqui para fazer para fazer o o o disparo. E esse esse aparelhinho que

a gente tá vendo aqui, não sei se vocês já viram, já conhece, é um aparelhinho que pega um capilar de vidro e aquece ele e estica. E ao fazer isso, ele tá criando duas pontinhas muito fininhas. São essas pontas que vão ser utilizadas para fazer o furo, tanto Aqui no embrião de camundongo quanto no embrião a do peixe. E aí, só para vocês terem aqui uma uma ideia de tamanho, esse aqui é um embrião de camundongo. A gente tá vendo aqui a zona pelúida, essa estrutura aqui é mais periférica, transparentezinha. Isso aqui é o corpúsculo

polar. Esse aqui é o o zigoto recém fertilizado, tá bom? Então, paraa gente fazer essa injeção, ele já tem que ser 2N, né? Não, não adianta eu fazer no oócito. E aí, repara, essa estrutura Aqui circular, essa eh essa estrutura é um dos pronúcleos, normalmente é o pronúcleo masculino. E aí a gente vem com essa agulha bem fininha, a gente consegue ver aqui um pouquinho dela e injeta a solução contendo o DNA. E aí no microscópio a gente consegue observar que o pronúcleo aumenta um pouquinho de tamanho. Isso é muito difícil de fazer e quando

dar certo vai gerar o animal eh transgênio. Quando a gente vai pro zebraf, repara aqui, né? Ó, ficou um Pouquinho coberto. A gente tem um embrião que é muito maior e ele é diferente. Essa parte que a gente tá vendo aqui mais opaca é que a gente chama de vitel, é o yok. E o embrião ele tá aqui só nesse ladinho aqui, no lado animal, né, que a gente chama de lado animal. Então, eh, aí, enfim, depende um pouco da da do autor que você tiver olhando na literatura. Tem gente que faz injeção no vitelo,

tem gente que faz injeção direto no embrião. Eh, você pergunta, cada pessoa gosta de um jeito de fazer, tá? No caso aqui eu tô vendo o corante foi injetado e aí repara que o tamanho dele é um embrião de fato eh bem maior. A gente consegue, né, basicamente ver até olho nu, né, uma bolinha pequenininha da nossa placa de petre, tá bom? Então se você me perguntar, é mais fácil injetar no zebraf do que no camundongo, mas claro que a gente tá usando aqui eh métodos, né, que são muito similares. Tudo bem? Então aqui a

gente tá vendo uma forma, uma das formas de fazer o delivery, né, de fazer a entrega dessa construção que foi produzida por clonagem molecular. A outra forma que é bem interessante é a chamada de eletroporação. Então eu tô usando, tô mostrando aqui uma foto de um sisteminha da NEPA. É um sisteminha muito muito legal. Existem vários outros também funcionam muito bem. E aí, repara que eu tenho, nesse caso aqui, nessa imagem, eu Tenho uma câarazinha com dois eletrodos. E aí a gente vai dar um choque ah na célula. Ah, a gente tá vendo aqui os

pulsos, né, com com, né, tem pulsos ah curtos com maior voltagem, pulsos longos com uma voltagem menorzinha. E esses pulsos vão gerar a poros, né? Então, pulsos para formação de poros. E e como o DNA é carregado, né, como a molécula de DNA é carregada, ele é carregado negativamente, ela vai ser estimulada a entrar por esses poros para ficar ah no Citoplasma da, no caso aqui do nosso zigoto. Existem algumas abordagens que conseguem botar esse DNA dentro do núcleo. E aí, obviamente, isso é é bem interessante eh pra gente ter o animal transente, tá bom?

E aí em seguida, eh, né, então aqui tem um o pulso de transferência, que são esses pulsos aqui, eh, eh, quadrados, né, a square Pulse. E a gente tem um segundo pulso de transferência, no caso desse sisteminha Aqui, que vai eh mudar a polaridade para tentar levar mais moléculas de DNA para dentro do nosso embrião. E essa é é tem sido uma estratégia muito utilizada, tá? Eh e atualmente, mas ela tem uma limitação. Alguém sabe me dizer que limitação é essa? Eu sei que vocês não podem responder, né? A s a tá gravada, mas a

a limitação é que depende do tamanho da molécula DNA. Então, quando eu falo de microinjeção, eu posso usar moléculas Que são maiores, moléculas que têm alguns cabis de tamanho. No caso de eletroporação, o ideal é que essas moléculas sejam o menor possível, tá bom? Então, a gente usa hoje em dia, ah, em muitos casos, a gente usa eletroporação de embriões para crisper. Crisper envolve, né? O nosso RNA guia bem pequenininho. A gente vai ter, eu vou mostrar para vocês que ele ele tem uma uma região específica que a gente define por bifomática, uma outra região

Que é conservada e aí a gente faz uma eletroporação desse RNA junto com a proteína, né, com a CNO. E isso eh isso entra, né, com com relativa facilidade no nosso e aí é justamente essa esse slide que eu queria trazer para vocês foi a partir da técnica de eletroporação, que aqui a gente no Brasil fez o primeiro camundongo knockout no Rio de Janeiro, né, no no estado onde eu moro há há pouco tempo, né, a gente tá falando aí de Praticamente 3 anos. Eh, e isso até então nunca nunca tinha sido feito no Rio

de Janeiro, tá? Então, o que é muito bacana, eh, a gente tem uma outra percepção do Crisper também que eu vou discutir isso com vocês. Eh, ele não só permite que a gente trabalhe com muitos tipos de célula, né, virtualmente todos os tipos de célula, ah, e aí a gente pode fazer modificações em diferentes espécies, eh, em parasitas, em arroz, enfim. Eh estratégias que eram antigamente limitadas a camundongo, rato e e embriões humanos. Hoje a gente não tem mais essa limitação. Eh, mas um outro ponto que eu gostaria de de trazer para vocês é a

possibilidade de fazer a democratização das das estratégias de edição gênica. Então, quando eu falei para vocês de microinjetor, né, de eletroporador, são equipamentos, são muito caros. um um Microinjetor, enfim, ainda mais você pensar em em real, né, na na moeda real, a a comparando com euro, comparando com dólar, a o nosso câmbio é muito desfavorável, então fica muito caro pra gente fazer a questão desse equipamento. A gente até tem, né? A gente tem um microjetor, a gente tem eletroporador aqui, é um laboratório muito bem equipado, mas eh é importante que a gente pense em formas

estratégias de gerar esses animais sem sem ficar muito Preso a equipamentos e reagentes. E o Crisper permite que a gente faça isso. Então aqui eu tô mostrando para vocês a alteração gênica, a gente tem uma uma deleção de sete nucleotídios. Ah, e aí, obviamente, isso vai levar uma mudança no frame de leitura, né, na janela de leitura. E a é esperado, né, por até por biformática que a gente vai ter eh uma proteína troncada Pela introdução de stopons prematuros. E aí quando de fato a gente vai olhar pra pra detecção dessa proteína, né, que é

a P2Y12, a gente percebe que a numa distensão sanguínea de um animal e white type, a gente consegue detectar essa proteína. Quando a gente vai pro para um outro esfergaço de um animal mutante, a gente não consegue, sugerindo de fato que deu tudo certo, né? Aqui tá o sequenciamento, aqui tá a uma complementação baseada na detecção de Uma proteína. A proteína não tá presente. Então, ah, isso confirma, né, que a gente tá tendo um animal eh diletada com com aquela pretina inativada. Isso foi feito, né, no no laboratório do professor Marcelo. Não tenho certeza, imagino

que ele deve ter dado alguma aula para vocês, senão é é um professor excelente e e super vale a pena eh conversar com ele também para pra gente ter essa visão, né, do de reprodução animal, de produção de Animais genéticamente muito modificados. Beleza? Aqui tem um outro exemplo de eletroporação. Na verdade, agora vocês já devem ter percebido que a eletroporação tá sendo feita em embriões de zebrafish. É um embrião transparente, é ótimo de trabalhar, né? Ainda mais porque a fertilização é externa. Isso permite coletar uma série de embriões com muita facilidade, o que é bem

contrário do que a gente tem no camundongo, né? a fertilização interna, O número de embriões é menor e e aí a gente precisa eh de técnicas cirúrgicas para fazer essa coleta de embriões. E o que esse artigo mostrou aqui, tá encoberto pela minha imagem, é um artigo de 2020 do Zang. A que a eficiência, né, de de eletropulação, a gente tá vendo aqui o sinal de IFP em várias células nesse caso, né, e em muitos casos. Quando a gente faz isso em zebraf, a gente tem imbrante chama de quiméricos, ou seja, algumas células recebem o

teu Plasmídeo, outras não recebem seu plasmídia. A gente percebe aqui, o que ele descreve é que é mais eficiente fazer essa eletroporação no estágio de oito células, o que é bom. Você não precisa, né, correr com com o embrião porque o dele é muito rápido. Você não precisa correr com o embrião recém fertilizado. Você você pode fazer as etapas, né, de de coleta e lavagem e preparação do DNA para fazer a eletroporação, né, no estádio um Pouquinho mais tarde, tá bom? Então, hoje em dia, para quem trabalha com zebrafist, né, já tá familiarizado com isso,

mas para quem não trabalha, eh, a técnica ouro é a microinjeção. Vocês viram lá o sisteminha, mas existe a alternativa de você também fazer eletroporação. Lembrando que eu falei sobre a questão do tamanho do TNA, tá? Se eu tiver trabalhando com construções que são muito grandes, eletroporação não é uma Boa ideia. Aqui a gente tem um outro sistema de eletroporação. Repara que nesse caso aqui tá tendo, eu não tô eletroporando um embrião, né, de de camundongo. Eu tô elendo uma injeção da minha solução de DNA no músculo, no músculo tibial anterior. E aí eu, após

a injeção desse dessa solução de DNA, é feita uma eletroporação usando aqui eletrodos, né, de ah de de de bastão. Mas aí o princípio é basicamente o mesmo, né? Claro que esse animal precisa est anestesiado. A gente tá vendo aqui é exemplo na foto. E isso permite que eu estude eh o caso, nesse caso aqui, a função gênica, ah, do meu gen de interesse, não desenvolvimento embrionário, mas em tecidos específicos. Nesse exemplo, eu tô mostrando para vocês o músculo estreado esquelético. Então, repara que eu tenho diferentes estratégias. a de entrega. Essas estratégias podem eh Ser

utilizadas em diferentes tecidos, em diferentes órgãos. E a gente tem aqui outras possibilidades, né? Então, vetores lenteivais, a adenovírus e, enfim, são, na verdade, eh, nanopartículas, né, de de lipídio. são outras estratégias que eu não vou focar muito nelas com vocês agora, mas que tm sido muito utilizadas, especialmente até ensai clínico, Justamente porque eh esses essas essas técnicas eh esses vírus eles sofreram várias recombinações, várias alterações ah para trazer mais segurança e impedir que eles infectem e se espalhem eh espontaneamente para outras células. Eles só vão infectar aquelas células de interesse. Ah, e hoje em

dia com isso a gente consegue alcançar células no corpo de indivíduos adultos que antigamente não eram alcançáveis, tá? Só para isso Ficar bem claro para vocês. Lembra que quando eu falei de microinjeção, eu tô injetando no zigoto. E aí eu dei dois exemplos, né? O zigoto de camundongo e o zigoto de zebrafish. Se eu fosse fazer microinjeção no animal adulto, qual seria a minha taxa de sucesso? né? Considerando que a gente tem trilhões de células. Quando eu faço no zigoto, aquela célula recebendo o meu a minha construção de DNA, ela vai proliferar, Vai gerar, né,

os blastômos, vai gerar a, enfim, outras fases do desenvolvimento, né, mórula, blástola e e eventualmente vai gerar todos os tecidos do embrião. E aí numa situação perfeita, né, numa situação ideal, todas essas células teriam recebido o meu DNA de interesse. Por que que eu falei numa situação ideal? Porque existem alguns casos que a integração do DNA só vai acontecer na depois, após a primeira divisão. E aí a gente vai ter Uma célula, né, do um blastômero eh com o teu transistômero Y type. E aí só os descendentes daquele blastômero é que vão carregar o teu

transgênio. E aí a gente tem o que a gente chama de quimera, tá? Tudo bem, gente? Essa é uma aula grande, mas tá gravada. Se você precisar eh fazer uma pausa, é só pausar o vídeo e voltar, tá bom? Aqui eu eu fiz uma brincadeirinha, né, de como é que a Gente pode fazer uma modificação gênica, ah, com essa reunião aqui dos transgênicos anônimos. Eu peguei a emprestado de uma amiga aí de Portugal, a lá do GC. E aí, pessoal, a de forma simplificada, a nossa criatividade é o limite, tá? Eu vou, a gente pode

fazer construções menores, maiores, com poucos elementos, com vários elementos. Eh, isso que vai, né, o que vai depender é é obviamente o nosso objetivo a do projeto, né, os Recursos que estão disponíveis e, claro, né, a a criatividade do do indivíduo, né, do pesquisador, do investigador que tá fazendo eh a construção pra gente, para ficar simples, eu trouxe o, né, o primeiro caso, o caso que é mais comum, o O caso que é mais simples, o caso que a gente usa em 90, 95% das vezes assim, tá? Então, pra gente fazer uma transgênese Convencional, claro,

a gente precisa do nosso gêno de interesse. Normalmente a gente tá falando aqui de situações que eu vou fazer ganho de função, eu vou aumentar os níveis de expressão daquele gene. Claro que se eu tô trabalhando com o inibidor, a gente pode ter, na verdade, um fenó tipo que tá, né, suprimindo uma via de sinalização. Eh, isso pode acontecer também, né? Eu posso ter mutações num gênio e e a gente chama de Eh dominante negativo, né? Ah, e aí isso vai levar uma competição e pode levar um fenote por perda de função. Mas de modo

geral, e aqui eu trouxe, né, um gênio que eu botei verdinho, como se fosse um GFP, eh a gente vai ter aumento dos níveis de expressão dessa desse gen de interesse. E isso é feito pela regulação, por uma sequência, né, que eu já mencionei para vocês lá no início, que a gente chama de região promotora, que pode ser ativa ah constitutivamente. Então, esse gene seria expresso em todas as células do do indivíduo. Ou eu posso ter um gene que é tecido específico. E aí essa, desculpa, eu posso ter um promotor que é tecido específico. E

aí esse gene ele só vai ser expresso, essa região só vai est ativa num determinado grupo de células e esse gên expresso naquele determinado grupo de células. Então, por exemplo, imagina que eu tenho um um promotor de hepatócito, só os hepatócitos vão ficar Verdes, que é o exemplo aqui que eu fiz nesse esqueminha, tá? Ah, ou eu posso ter um promotor que ativo apenas em neurônios ou num subgrupo de neurônios. Então, só uma região específica do cérebro do animal que vai ser eh que vai ter células GFP positivas. Aí você pode estar pensando assim: "Ah,

então, Arlon, como é que eu faço para genotipar esse animal? Eu vou precisar acessar o órgão de interesse para para extrair DNA genômico?" Não. Óbvio que você quer ver No órgão se as células ficaram verdes, nesse exemplo aqui que eu tô dando. Mas você pode pegar virtualmente qualquer célula do embrião, desculpa, qualquer célula do indivíduo, né? Ah, normalmente a gente faz isso com com camundongo jovenzinho. A gente pega uma pontinha da calda, tá? Faz a extração de DNA genômica e aí usa usa basicamente usa PCR para identificar se aquele animal é transênico ou não. Por

quê? Lembrando que a A microinjeção levou o DNA para todas as, né, idealmente para todas as células filhas, só que o gene só vai ser expresso, só vai est a ativação do promotor naquele tecido eh desejado, naquele tecido de interesse. Nas outras células, o a construção vai est lá presente no genoma, mas o gênio não vai ser expresso, tá bom? E aí um outro elemento que eu acabei não mencionando anteriormente, mas que é super importante, é o que a gente chama de Cauda de poliadenilação ou cauda poliar. É essa essa sequênciazinha do DNA que vai

sinalizar pro ribossomo, né? Ele ele é rico a a em, né? Poliar ou T. E aí ele faz uma alça pro ribossomo quando chegar lá ele se soltar a da molécula do no caso aqui do, né, do RNA mensageiro, tá bom? Então aqui eu trouxe para vocês uma característica importante das regiões promotoras, a gente chama de sequência de COAC, né, que tá Relacionada à ligação ah de fatores de transcrição, de RNA polimerase. E aqui é o famoso start codon, né, o ATG que vai codificar uma medianina, tá OK? Então você faz essa clonagem no laboratório,

na bancada, utilizando, né, todas aquelas ah estratégias que eu mostrei para vocês, né, plasmídias, enzimas de restrição, PCR. Ah, faz screens, sequencia, confirma que tá tudo certo, tá todo mundo no local onde deveria ficar e aí Você purifica esse essa construção e aí faz a microinjeção pronuclear. No caso aqui a gente tá mostrando, né, um embrião de camonomo injetando no pronúnclo masculino. É a mesma foto que eu mostrei anteriormente. Você pega esses embriões recém ah injetados e transfere para uma outra fêmea, né? Uma fêmea que foi tratada hormonalmente para receber esses embriões, né? ela ela

ela receber os embrones, ela vai ser capaz de manter a gestação e aí ao final de Mais ou menos 20 dias, depende um pouquinho de cada linhagem, mas em média 20 dias a gente vai ter o nascimento ah de de de vários pups, né, de vários bebezinhos. E alguns vão ser transgênicos, outros não vão ser transgênicos, tá bom? Eh, você deve estar pensando assim, alguns quantos varia muito uma uma pessoa muito experiente que que com, né, que tem uma mão muito firme, muito bem treinada, ela consegue Uma taxa de sucesso em torno de 10%, eventualmente

chegando até 40%. Tá? Então, a tecnologia que trabalhou comigo, né, quando eu tava aí no GC, ela conseguia, em alguns casos, 40% de eficiência, era espetacular, a gente ficava muito feliz. Eh, em pessoas que estão começando a fazer o treinamento, talvez só do só do ter um nascimento já é uma felicidade, porque é uma técnica realmente muito trabalhosa, muito difícil e nem sempre a Gente consegue acertar de primeira, tá bom? Ok? Então, só para vocês terem uma noção, eu não vou fazer uma discussão tão detalhada aqui, senão vocês vão ficar entediados. Eh, essa a produção

de animais transicos envolve várias etapas, estão distribuídas em vários dias de preparação. Eh, é realmente um um protocolo bastante ah trabalhoso, né, laborioso, com várias com vários detalhes que precisam ser feitos. A a primeira coisa É fazer vasectomia em alguns machos, porque são os animais que vão cruz, né, que vão cruzar com algumas fêmeas, mas que não vão ser capazes de gerar eh prolle, justamente porque eles estão vazectomizados. E aí essa fêmea, ela vai acreditar que tá grávida, mas ela não vai ficar grávida, tá? ela vai receber, né, o tratamento hormonal, ah, para estimular o

uterino, para ele ficar eh propício, né, para receber os Embriões. E aí, claro, num outro grupo de fêmeas e e machos, a gente vai fazer o cruzamento, vai obter os zigotos, aí sim, né, são animais férteis. Eh, e a partir da injeção desses zigotos, aqui tem um tratamento enzimático. A gente tá tirando as células do, né, do cumuloóf, da coro radiada. A gente tá vendo aqui a zona pelúcia aqui vocês conseguem ver o corposculpar. Aqui tem alguns embriões não viáveis, por exemplo. Aí esses esses Embriões vão receber o DNA, né, pela microinjeção. E depois esses

embriões que foram injetados, eles precisam ser transferidos para essas fêmeas. eh, inicialmente pseudográvidas. E aí, claro, né, dando tudo certo, a gente tá vendo aqui a transferência na ampola, né, do do ouvido. Eh, é uma técnica cirúrgica que tem algumas, né, alguns detalhes, precisa ser muito bem treinada, mas dando tudo certo, a gente vai ter a gestação e aí ao final daquele Período que eu falei, né, de mais ou menos 20 dias, a gente consegue fazer a extração del genônico, fazer genotipagem. Aqui eu tô mostrando para vocês que eu tenho, né, animais transgênicos. São essas

bandinhas que tão eh acesas aqui nesses nesses dois exemplos, tá bom? Então, gente, repara que esse protocolo é um protocolo complicado assim, né? É um é um protocolo que dá bastante trabalho. Na época que eu que eu morei em Portugal Tinha um único laboratório, foi o laboratório que eu fiz o meu doutoramento, que fazia esses animais. Hoje em dia eu não sei se tem mais algum. Ah, vou até pesquisar depois para saber, tá? Eu sei que esse laboratório continua fazendo, tá? E agora a gente no Brasil tá tentando, né? Tá, tá começando a fazer também,

tá bom? E aí, olha que legal, gente, olha como é que essa técnica é poderosa. Eu posso fazer um animal Transênico com promotor de de músculo. E e repara que eu tenho aqui vários núcleos que tão ah marcados ah com lac Z, porque esse lac Z ele tem uma sequência de localização nuclear. Então, quando tem a a a expressão a produção dessa proteína, essa proteína vai pro núcleo e a gente tá vendo aqui eh essas esses núcleos em azul numa fibra muscular estriada esquelética. E aí, se você faz algumas imunomarcações nessa nesse material, a gente

consegue ver, Por exemplo, que tem uma outra célula que não tem a marcação do lac Z. E aí essa célulazinha aqui, ela começou a ser caracterizada. E hoje em dia isso tá muito bem claro, né? Ah, que é uma célula que a gente chama de célula satélite, tá bom? Então, repara que a célula satélite ela não tem a ativação daquele promotor ah específico de de músculo. Legal? E aí com isso você consegue quantificar o número de células satélites a em cada célula, né? O número De o número de células satélites em cada fibra muscular, tá

bom? Eh, e enfim, esse é um trabalho de 2005, ah, com e e serviu de base para muitos outros trabalhos desde então. Eh, aqui é basicamente a mesma coisa, só que eu tô mostrando para vocês a da transenia em zebra fish. Então, o nosso elemento DNA poderia ser o mesmo, tá? Dependendo basicamente, enfim, da sequência do promotor, poderia até ser o mesmo promotor, se a gente souber que é um Promotor que tá sendo expresso em células de camundongo e células de zebraficho, funciona, tá? Eu us usei, por exemplo, promotor de rato para expressar em camundongo.

Ah, a gente usa promotores de vírus para fazer expressão em camundongo também. Então, então assim, é uma questão de tentativa, eh, empírica, né, de de tentativa e erro. E aí você vê se aquele promotor é ativo na tua no teu na tua espécie de interesse, tá bom? E aí, gente, qual é a diferença Aqui? que nesse caso, como eu tenho um desenvolvimento muito rápido do embrião de zebra fixe, ah, e essa injeção normalmente é feita a no vitelo, é comum que a integração ocorra em pouca em uma ou poucas células ah de um embrião mais

desenvolvido. E aí eu tenho, né, vocês viram naquele exemplo lá da eletroporação, eu tenho o que a gente chama de quimera. E aí, para eu ter um animal que é completamente transgênico, eu preciso cruzar essa quimera, torcer Para células da alagem germinativa terem sido, né, terem recebido também o o meu transênio. E aí eu preciso fazer cruzamentos para ter a perpetuação, a manutenção e eventualmente até a homozigotia. Tudo bem? Então, cada espécie tem a sua particularidade, mas enfim, cada cada espécie também tem suas vantagens. Hoje em dia, ah, tá relativamente comum a gente usar, eh,

vírus para fazer transgênese. Então, nesse caso aqui, a Gente tá vendo que eu tenho uma partícula viral, desculpa, uma partícula viral, eh, que vai levar a expressão de da recombinase CRE. A gente não falou de CR com vocês, mas o que que acontece com essa nuclease? Ela vai reconhecer sequências específicas, são esses triângulos aqui, que a gente chama de lox P. Nesse caso, a gente tá reconhecendo esses dois triângulos e vai remover o gene repórter de vermelho, né, O o tomato aqui. E aí nas células que essa recombinação aconteceu, a gente não vai ter mais

vermelho, a gente vai ter verde, tá? Então é o que a gente tá vendo aqui nesses exemplos. Eu tenho embriões que algumas células não sofreram recombinação, tão vermelhos. Eh, em alguns casos eu tenho células que ficaram vermelhas, né, que se mantiveram vermelhas, outras que foram verdes. E aqui células, né, o embrião inteiro tá verde e é o que a gente tá vendo aqui Nesse caso aqui, o embrião que é que sofreu essa recombinação em todas as células. Aqui eu tenho as quimeras e aqui onde não teve recombinação, tá? Então, olha, olha que bacana. Eu coleto

os embriões, eu faço essa transfecção eh numa plaquinha ah de petre, mantenho elas em culturas por pouco tempo ,, né, ou três dias aqui nesse caso pra gente ver a no microscópio de fluorescência ou eu posso no dia seguinte fazer a transferência para um para uma fêmea que Recebeu aquele tratamento, né, que cruzou com o macho é vasectizado, recebeu os hormônios E aí a gente vai ter os pups nascendo aí mais ou menos depois daqueles 20 dias. E aqui a gente tá vendo as fotos, né, mostrando que a vetores verais são capazes de fazer essa

entrega de DNA, tá? Esse é um trabalho um pouco mais recente, né, de 2018, mas que que enfim tá sendo bastante usado, Lembrando também aquela limitação de tamanho, né, como o a gente precisa ter um vetor veral, normalmente o DNA que tá ali dentro, ele é um DNA menor, né, de de tamanho reduzido. E aí a gente consegue ver aqui nesse caso, ó, eu tenho animais que ficaram, né, os pupzinhos, os bebezinhos ficaram a verde fluorescentes, mostrando que a recombinação aconteceu eh em todas as suas células. E aqui eu tenho outros outros onde não tiveram

recombinação, tá Bom? E repara que o vermelho aqui tá apagado, o verde aqui tá aceso. Legal, né? Ah, e aí por que que eles fizeram isso, gente? Porque eles queriam saber se eles poderiam injetar o o adenovírus na ampola e o eletroporar nouto. E isso é muito, né, se isso funcionar, isso é muito mais rápido, porque eu não preciso ter marchactomizados. Eh, diminui o número de de cruzamentos que precisam ser feitos. a, né, a própria manipulação. Você não precisa transferir o embrião. O embrião já tá lá dentro, você vai só com uma agulha muito fininha,

a gente tá vendo ela aqui injetar eh o teu o teu adenovírus junto com um corantezinho. Aí depois você vem lá com os eletrodos e faz o eletroporação. E aí a gente tá vendo aqui justamente a que funciona, tá? Então a gente tem a quantificação, a gente tem aqui o fenótipo e aí a estratégia aqui que é muito bacana, né? Ah, esse esse animal que sofreu a Recomendação, ele tem uma uma cor do pelo branquinha, enquanto esses outros a que não sofreram tem a cor da pelagem preta. Então, é uma outra forma bem elegante da

gente conseguir acessar eh se teve uma recomendação sem precisar, enfim, e coletar órgão, sacrificar o animal. Tá bom? Bacana, né? Agora, essa técnica que é muito poderosa, que trouxe pra gente muita informação, né? Imagino que se vocês quiserem fazer uma pesquisa no Pub Média para Identificar artigos foram que usaram animais no transgênicos, vocês vão achar vários. Eh, e ela tem vantagens, desvantagens. De modo geral, comparando com a estratégia clássica de knockout, é uma técnica mais simples, mas a gente não tem controle da localização nem no número de cópias que podem ser integrados no genômio. Então

eu posso fazer um animal fundador que três cópias se integraram no cromossomo quatro e um outro Animal, né, que foi um outro embrião da mesma injeção, do mesmo dia de injeção, ele não recebeu nenhuma cópia. Ou recebeu uma cópia só ou recebeu 10 cópias, só que aí recebeu no cromossomo Y, por exemplo. E aí o nosso padrão de herança vai ser completamente diferente, tá? Então essa é uma característica muito importante, né? né? Até quando eu conversei com vocês sobre a diferença de de transênico para é que no transênico a integração não é Direcionada e o

número de cópias não é controlado, tá? OK? E isso, dependendo da posição que essa, né, que essas construções se inserirem, a gente pode ter um animal que é transgênico, que tem lá, né, a integração no genoma, mas que por alguma razão caiu numa região que foi silenciada ou que ativou a maquinaria de reparo da célula. Isso vai levar alguma recombinação que vai trazer aí eh um padrão de herança não mendeliano que Complica um pouco a nossa vida, tá bom? Então, muito cuidado tem que ser feito na hora de fazer a caracterização desses animais. E aí,

ah, de forma bem pragmática, uma coisa relativamente simples que a gente faz é tentar gerar o maior número de fundadores possíveis, 3, 4, 5, o maior possível. E aí você vai cruzando esses animais e vai vendo eh se o fenótipo é forte o suficiente, se o padrão de herança é mendeliana, ah, se por acaso for um Repórter, se ele tá sendo expresso na na região que ele deveria ser, tá? Esse tipo de coisa. Tudo bem? Isso porque, como eu falei para vocês, dependendo da região, a gente tem o que a gente chama de efeito posicional.

Então, nesse caso aqui, o nosso gen repórter deveria ser expresso no nos hepatótes, no fígado, mas é aqui a gente tem ele tá na posição, ele tá no local certo, mas ele tem um sinal mais fraquinho. Nesse outro caso, ele tem um Sinal forte, mas ele tá em vários órgãos, em várias células, em em vários tecidos, então não é um animal de interesse pra gente. Ou esse caso aqui, que o animal é transgênico, né? você faz lá a análise da do DNA geômico, ele tá presente, mas a gente não tem a expressão eh do nosso

GFP no órgão de interesse. Então, quando isso acontece, a gente precisa usar outros elementos reguladores, ah, para poder direcionar e aumentar o sinal ah daquele gên de Interesse, tá? OK. Normalmente, na maior parte dos casos, isso aqui é suficiente, tá? Em casos menores, pouco prováveis, a gente precisa eh utilizar esses outros elementos, tá bom? E aí aqui tem um resuminho, né, da da complexidade de design, né, de de transên que a gente pode fazer. Então aqui é o caso inicial que eu mostrei para vocês, promotor, região codificante, calda poliar. Aqui tem a Adição de um

erranc eh eh coloca-se um intron entre o primeiro exon e o segundo exon. Aqui a gente adiciona eh isoladores e a gente pode eventualmente chegar até no num bac, né, num num cromossomo artificial bacteriano para levar o locus a endógeno, né, genômico endógeno. Repara, gente, que a gente tá aumentando a complexidade, né, do o alto aqui no alto é mais simples. Conforme a gente vai indo aqui pra parte de baixo do slide, a Gente tá chegando em em clonagens mais complexas, mais trabalhosas, que vão demandar mais esforço nosso, mais tempo para serem alcançadas, tá bom?

Então, o ideal é sempre começar pela pelo mais simples. E aí, olha que bacana, esse aqui é um exemplo ah de uma colega minha que tava fazendo um doutorado na época que eu cheguei lá em no laboratório e ela tava estudando o efeito do Gis Rocks na padronização do do esqueleto taxial. Aqui eu tô vendo um feto de camon com 18 Dias e meio. Repara que eu tenho as costelas, né, na região toráx eu tenho a região lombar sem costelas. E aí se ela fizer um ganho de função, a hiperespressão do genox B6 num local

dirigido por esse promotor DLL, né, Delta Like Promoter, que ele é ativado especificamente a no mesoderma promítico, a gente consegue induzir costelas na região lombar. Aí vocês devem estar pensando assim: "Nossa, que diferente, a gente tem, né, Conhecido animais que t costelas na região lombar, né? O exemplo são as cobras e os elefantes." Então, será que esse mecanismo eh pode explicar porque cobra de elefantes tem costelas na região lombar? Mas antes da gente chegar nessa nessa resposta, eh, se ela trocar o Gen Rocks, é o mesmo promotor, mas ela trocar o Gen Rox agora devia

ser um gênio do grupo seis, eh, for um gênio do grupo 10, a gente consegue suprimir a Diferenciação de costelas da região toráxa. É claro que esse animalzinho aqui, né, ele ele foi coletado antes de nascer e ele não seria viável ah justamente por não poder fazer a a respiração independente, né? A gente tá pensando, é, mas ele consegue respirar eh durante o movimento? Consegue, claro, né? Lembra da placenta. Então, a mãe vai fazer a hematose e o sangue oxigenado vai chegar naquele feto de desenvolvimento justamente a pela Placenta, tá bom? Quando ele nasce, isso

é interrompido e aí ele não conseguiria ah se manter. Provavelmente ele seria ah existe canalismo, né, no no escamudongo, então ele seria devorado pela mãe. Tudo bem? Ah, eu acho que eu não trouxe isso, mas eh um slide para mostrar para vocês, mas só para só para mostrar, né, para continuar o que eu tinha mencionado. Eh, parece que parece não, né? O o Moisés num outro trabalho identificou que tem Uma região reguladora de um gene associado à diferenciação muscular, né, o MIF 5. Então tem uma região reguladora do do MIF 5 que vai ser reconhecida

pelo Rox B6 e pelo Rox A10 e que em cobras e elefantes essa região tá mutada e aí o Roxa 10 não consegue se legar e a gente vai ter então a formação de costelas até a região lombar, tá? Esse é um exemplo que eu acho muito bacana para mostrar para vocês que a gente consegue usar essas técnicas moleculares, né, de Engenharia genética para estudar a evolução e e enfim, hoje em dia a gente tem vários trabalhos que usam engenheir genética para estudar a evolução, não só em vertebradas, mas em drosfila, né, em celegans, enfim,

em várias outras espécies. E tem um outro caso ah que pode ser bastante frustrante que a gente chama de letalidade embrionária. Então repara aqui. Nesse caso eu fiz um, né, até um trabalho meu, Ah, foi publicado em 2013. Ah, eu fiz um ganho de função de um receptor, um receptor da via de TGF beta com uma mutação CA aqui tá dizendo que ele tá sempre ativo, é constitutivamente ativo. Então esse e todas as células onde esse promotor eh é ativo, vão ter a expressão desses genes ah ligado o tempo todo. E aí, olha que bacana.

Ah, nesse caso, o ganho de função desse receptor é isso é feito para você não depender da disponibilidade de ligante. Ah, o ganho de função desse receptor causa uma terminação precoce do crescimento do embrião. Então, a gente tá vendo aqui um embrião de de camundong, né, com a sua caldinha bem formada aí, 10 dias e meio de movimento. Aqui tá o for limbo. Aqui tá o rin limbo. Aqui a gente tá vendo os arcos farines, o coração tá aqui atrás escondidinho. Ah, nesse caso aqui a gente tá vendo o coração, a gente tá vendo o

forling, mas a gente não tá Vendo o tronco. E a gente tem uma massa de células aqui mal formadas, sugerindo que essa sinalização tá bloqueando, né, o a ativação da sinalização tá bloqueando a continuação do da da extensão axial. E aí a gente tem uma questão, né, apesar desse fenótipo ter sido bem legal, eh, como é que a gente faz para estudar a função desse gênio se no desenvolvimento inicial do do embrião ele causa um fenótipo que vai levar ele à morte? E aí para isso a Gente tem o que a gente chama de transgênese

condicional. Como é que é feita a transgênese condicional? Depende. A gente tem várias estratégias, tá? Mas basicamente ela tá associada à utilização de sistemas binários. Então, nesse caso aqui eu tenho um elemento direcionador, né, driver, que aqui nesse exemplo a gente vai ter um promotor que é ah tecido específico ou ou tempo específico, tá? é essa região aqui que Vai definir a localização e o tempo, a, né, o quando esse gênio vai ser expresso. E agora nesse caso aqui, nesse exemplo que eu trouxe para vocês, a gente tem uma proteína que a gente chama de

transativador. E aí, repara o seguinte, quando esse elemento aqui, quando esse transativador fori expresso nesse grupo de células ah onde o o o errâncer e o promotor aqui são ativados, a gente vai ter então uma proteína que vem aqui e Vai se ligar nesse promotor que a gente chama de promotor TET. E aí com isso a gente vai ter um ganho de função e a expressão do nosso gên de interesse. Então repara que nesse caso eu só vou ter a a ligação quando esses dois elementos tiverem juntos. E aí eu tenho algumas variações, né? Então

o o sistema inicial, o que foi eh primeiramente, né, que foi inicialmente descrito, é chamado T off. Como é que ele funciona? Eu tenho aqui um promotor Tecido específico e ele vai eh direcionar a a ativação, né, no ele vai ser ativado nesse tecido e vai direcionar a expressão de uma proteína que a gente chama de TTA. Essa proteína vai ser produzida e nas células onde, né, esse esse promotor é ativo, ela consegue se ligar no promotor de tetes, na ausência de um estímulo. Então, sempre que esse estímulo não tiver presente, a proteína TTA se

liga e vai levar a expressão daquele higiene Letal. E aí, nesse caso, aquele embriãozinho, ele vai eh vai ter seu momento eh interrompido. Agora, se durante a gestação eu tratar a a fêmea grávida e aí consequentemente isso vai chegar no sangue pro pros pro feto de desenvolvimento. Eu tratar a fêmea grávida com um antibiótico chamado doxiclina, a doxiclina vai se ligar a ao TTA, vai gerar uma mudança conformacional e vai e essa mudança conformacional vai bloquear, vai impedir Que ocorra a ligação do TTA ao promotor responsivo de TETs. E aí com isso eu tenho a

a, né, eu desligo a expressão daquele gênio. Então repara, o sistema chamado off, justamente porque na presença de doxiclí o sistema é desligado e aquele gene letal ele não vai ser expresso, tá bom? E aí eu, a, a partir de engenheir genética, foi feita uma alteração a do desse sistema. E agora eu tenho um TTA reverso, RTTA. Aqui faltou um rzinho. Ah, que na ausência de doxiclina, a proteína que foi engenheirada, ela não vai conseguir se ligar o pro motor e aí aquele gene ele não tá sendo expresso. O desenvolvimento consegue ocorrer eh de forma

normal, sem letalidade embrionária. Agora, quando eu trato a fêmea grávida ou as células mais tarde, né, quando o animal chegou na fase adulta, eu trato aquele animal transgênico ah com doxiclina, aí a Doxiclina se liga nesse RTTA, o RTTA se liga no promotor da TET, induz a expressão do gêne. E aí eu consigo fazer o estudo, tá bom? Então, nesse caso, a presença da doxiclina tá ligando a expressão do meu gênio. Por isso que eu tenho esse sistema. Ah, sendo nomeado T on. Aqui eu tenho uma comparação, agora o Rzinho tá aqui, eu tenho uma

comparação do dos dois sistemas, tá? Então, no caso do TET off, na ausência de docxiclina, eu tenho a expressão do Meu gene de interesse. E no caso do te on, na ausência de doxiclina, eu não tenho expressão de interesse. Eu só vou ter ativação quando a doxiclina for administrada. E aí com isso a gente consegue estudar a função daquele gênio, né? Dá para perceber que o sistema TET ON hoje em dia ele é preferível porque você só vai precisar se preocupar em fazer administração de noclina na fase específica que você quiser estudar. Caso, por alguma

razão Você precise usar Office, você tem que inibir a a expressão do seu gêno de interesse ah desde o início. E aí você vai parar a administração de doxiclina na hora que você quiser avaliar a o ganho, né, a expressão do seu gênero, tá bom? OK. Então aqui eu trouxe para vocês ah um exemplo desse sistema em zebra fich em camundongo é muito similar. Desculpa gente, camundongo é muito similar, tá? Eu preciso construir um peixe ou um Camundongo transgênico ah pro meu driver. aqui o meu promotor que vai especificar o quando e o onde o

TTA, o RTTA vai ser expresso. E aí eu tenho um outro animal que aqui tá identificado como número dois, né? Aqui identificado com o número um. Ah, esse outro animal vai ter o promotor ah responsivo de tet aqui, tá? O, né? Tet O, mas é aquele PET, mesma coisa, tá? Na verdade, aqui essa é uma sequênciazinha que tá dentro do Petete. Ah, e aí eu preciso cruzar esses dois animais para, né, obviamente com herança mimeliana chegar a produzir um animal que tem os dois elementos. E aí a partir disso eu posso fazer os tratamentos ou

não, dependendo aí de qual sistema eu tô utilizando, tá bom? Nesse caso aqui eu botei um exemplo que que o G tá sendo expresso no cérebro do peixinho. OK? Legal. A gente tem um outro sistema binário que é muito muito importante, que é muito utilizado, que é Chamado a Crelox, né, que é baseado em recombinar, são sítios específicas. E aí tem uma outra variação que é chamado Flip FRT, tá? Então, só para vocês e isso ficar bastante claro, tanto a CR quanto a Flip são enzimas, são recombinados e a CR reconhece uma sequência chamada lox.

E a Flip reconhece uma sequência chamada FRT. Aqui a gente tá vendo a sequência a, né, de cada uma delas, a ordem inclusive para cada uma dessas Sequências. E aí o que é muito importante a gente notar aqui, e por isso que eu usei essas representações, é que elas têm direcionalidade, tá? Por que que o que que eu quero dizer com isso? Se eu tenho se eu conseguir inserir um loxp flanqueando o meu geno de interesse, essa região verde clara aqui, tá? E aí eu tenho um outro lockp do outro lado. Quando eu adicionar a

CR, ah, desculpa, aqui eu tenho eles na Mesma orientação, tá? Aqui eu tenho um lockp, um apontando para um lado e aqui o outro apontando pro outro lado. Ok? Então, repara o seguinte, quando eu coloco a recombináia, né, a CR recombinas, se eu tenho o lox P, todos os dois na mesma orientação, a gente vai ter uma deleção. Essa essa enzima reconhece o lox P, pega esse lox P, se aproxima do outro lox P e aí a gente deixa ela, ela é capaz de deixar um lox P no local. Então, essa região verdezinha que a

gente tá vendo aqui é essa região que a gente tá vendo aqui. Essa região que a gente tá vendo aqui é essa região que tá aqui. E aí tudo que tá no meio é é removido. Então isso aqui leva uma deleção. Nesse outro caso, a gente e repara aqui que eu fiz até um gradiente, tá? Repara que elas estão em orientações opostas e aí a gente vai ter o que a gente chama de inversão. Então, a gente tem uma formação de um de um DNA Circular, mas não tem a remoção a daquele material que tá

aqui dentro, ele é só e invertido, tá bom? E isso também pode ser usado para você ligar e desligar um gênio, mas é claro que o principal, a gente usa muito essa estratégia aqui para fazer deleção condicional, tá? Então aqui eu tô mostrando um exemplo onde eu tenho um animal eh transgênico, que é MIF, é promotor de MIF 5, né? Um um promotor que é Específico para fibra muscular, ah, com repórter lax. E aí a gente tem aqui alguns marcadores, então, né, Pack 7 mostrando, né, a núcleos que são positivos para PX. Aqui eu tenho

um núcleo que só esse núcleo é positivo para beta gal. Esse outro núcleo que a gente também que ele não é positivo. E repar aqui que a gente tem a uma coloração para adap, né? Uma contracorada counter strain para. E aí a gente vê, por exemplo, que esse núcleo Aqui ele é positivo para betagal, positivo pr pra packs 7, tá? E enquanto esse outro aqui ele não é positivo pra betagal, tá? E nem pra Pax 7. E nesse outro caso aqui, a gente tem um núcleo que é positivo para PXET e só ele não é

positivo para betagal. E aí isso levou a a identificação de uma população de células packs que é positiva para betagal, que corresponde mais ou menos 87% da população de células satélites. E A gente tem uma população menorzinha, né, em em proporção que é positiva para PAX 7, negativa para betag. E aí a gente pode usar essa estratégia de crer recumbase para eh avaliar os descendentes dessas células satélites. Então aqui foi feito uma alagem com o mesmo promotor, MIF5, tá? MIF5 CR. E aí sempre que esse promotor tiver ativo nessas células, né, no nesses núcleos das

células musculares, a CR vai entrar e aí como ele foi cruzado com o animal Que a gente chama de rosa 26, que é esse desenho que a gente tá vendo aqui, a gente vai ter a remoção dessa sequência de estoque. Então o que que a gente tá vendo aqui nessa imagem? Eu tenho um promotor rosa 26 que é constitutivo, ele vai est sempre ativo, só que agora eu tenho uma sequência de stop flanqueado com lockp, né? Flankeado com loxp é o flox, né? Que vocês já devem ter ouvido falar. Então, nesse caso, o tá sendo

expresso Porque a a gente tem uma barreira pr pra sua expressão, tá? Aí quando a cria é produzida nesses animais transgênicos, né, nessas células que expressam mif, ela vai pegar esse esses dois locksp e o que que a gente vai ter? A gente vai ter uma remoção, a gente vai ter uma deleção. E aí, como esse promotor é constitutivo, o que que vai acontecer agora com o AFP? Ele vai ser expresso. A gente vai ter células que vão ser o AFP Positivas. Então repara que nesse caso aqui, ó, eu tenho uma célula que é packs

7 positiva, que é o AFB positiva. E a gente tá vendo aqui que ela corresponde a mais ou menos 90% da população PAC. Agora eu tenho um outro caso aqui que eu tenho uma célula que também é pa 7 positiva, mas ela não tá positiva. Significa dizer que em nenhum momento, né, e teve essa recomendação. E aí a gente tem uma sala aqui que é exclusivamente packset positivo ou Negativo e é uma população menorzinha, tá? Então a partir desse tipo de experimento, eh eh chegou à conclusão que eu tenho uma célula antecessora, né? eh, que

é pack 7 positivo, FP negativo, no caso, né, MIF 5 negativo e eventualmente essa célula vai se diferenciar e vai gerar células são packets, eh, se mantém packet positivo, mas aí o MIF C passa a ser ativado, passa a ser expresso aí leva a recombinação, tá tudo bem, gente? Então, Isso aqui, repara, isso é muito elegante, né? Eu fazer isso, isso foi feito em 2007. Eh, a gente tem aí uma uma possibilidade, né, de de futuras investigações aí muito bacanas, tá bom? Ah, e aqui acabou ficando um pouco encoberto por mim, mas é só pra

gente ver a distribuição dessas células packset a na parte periférica da fibra muscular, tá bom? E aí a gente tem, né, a lamininha, tem tem mer para fazer a caracterização desse nicho das células Satélites. E esse aqui é o mesmo artigo a mostrando a a não em vivo, né, em exvivo, mas mostrando em ao longo do tempo. Então a gente tá vendo aqui a céa positiva. Legal, né? Eh, e aí a gente pode fazer muita coisa com isso. Então, nesse caso aqui, eu tenho uma construção que eu tenho três genes repórteres flanqueados, né, com com

uma variação do lock P, que esse lox 2272. Aqui em amarelinho eu tenho lockp flanqueando nessas duas posições e eu tenho a por causa disso eh possibilidades diferentes de recombinação. Então, nesse caso aqui eu tenho uma célula que vai expressar as três cores. Nesse caso aqui de baixo, verdade, desculpa, gente. Eu tenho aqui essa célula que vai que vai ter o elemento ah completa. E aí a gente vai ter uma cor vermelha. A gente tem aqui Uma célula que teve recombinação eh entre o lox 2272 e aí removeru o vermelho. A gente vai ter a

célula na cor azul. E aqui eu tenho a remoção tanto do vermelho quanto do azul. Eu vou ter só o AFP ah numa cloração mais para verde do que para amarelo. Mas mas então a gente vai ter essas três cores. E aí repara o seguinte, como a sala tem dois alelos, eu posso ter uma mistura na mesma sala de vermelho vermelho, vermelho azul, Vermelho verde e todas essas outras combinações. E isso leva o que a gente chamou de arco-íris, né? Então isso isso foi feito em Zebraf Fish em 2013, né, por PAN. Ah, e a

gente tá vendo essas combinações todas aqui, tá? Eh, e isso também pode ser feito em Camudong. Na verdade, isso foi feito em Camudong também, tá bom? E aí, o que que é bacana? Eu posso seguir os descendentes dessas células, né? Ainda mais conseguindo manter o o como Embriano transparente, a gente consegue manter ele eh o desenvolvimento em água. Aí você põe no microscópio e e mantém, né? Então repara como isso é muito poderoso, isso é muito bacana. No caso, como não é muito pouco limitado porque ele é bem maior e e o tecedor é opaco.

Desculpa, gente. E aí tem um outro lance, né? Eu mostrei para vocês da CR e a CR vai fazer a recombinação sempre que ela for for expresso. Agora eu tenho uma Variação da CRA que torna ainda um controle mais refinado, que é uma CRA com um domínio do receptor de estrogênio. Então a gente tá vendo aqui um complexo proteico, ah, que é formado por um domínio de ligação estrogênio. E aqui a gente tem, né, os componentes de ativação da transção e de ligação ao DNA, né, que é aqui que vai reconhecer o loxp, por exemplo,

numa situação sem o análogo do estrogênio, esse complexo proteico, ele vai ser ligado para uma Hecho shock protein e isso impede que a CR transloque pro núcleo. Agora, se eu fizer a administração ah de um análogo de estrogéio, ah, esse esse análogo se liga, né, a ao domínio de ligação, muda a conformação proteica, vai ocorrer a a separação da hitrock prot e aí com isso a crear no núcleo e aí vai fazer a recombinação, tá? E aí um análogo que a gente usa bastante chama Tamoxifena, mas existem outros, tá bom? Legal, né? Então aqui, ó,

eu tô mostrando para vocês um exemplo, um exemplo que foi feito por mim no no meu doutorado, ah, onde a gente gerou uma linhagem transgênica com promotor de linha primitiva para eh ter a expressão de crer r e a gente vê os descendentes daquela das células que passam pela linha primitiva. Então, repara que quando eu não trato o os animais, a minha cria tá inativa, ela vai ficar do Lado de fora do núcleo. Eu cruzo esse animal com o meu repórter AFP. né? Lembrando aqui eu tenho stop, a um sinal de stop bem similar ao

que a gente viu pro pro MIF5, só que agora eu tô usando, devido usar o MIF5, eu tô usando um promotor ah de braquulho. E aí eu trato essa fêmea grávida com tamoxfeno. E aí nos embriões que não receberam o meu transgên, eles não vão ser afetados, a Gente não vai ter combinação, eles não vão ter células fluorescentes. Agora, naqueles embriões que receberam ah pelo menos um alelo, né, que do do transgênic, né, do tec er, ele vai recombinar na presença max, ele vai recombinar o meu stop column, como a gente tá vendo aqui, né,

os dois elementos estão juntos. Aí ele remove o stop. Ah, e aí o promotor construtivo roda 26 vai levar a expressão da OFP. A gente vai ter eh células OFP positivas. Ah, e isso foi feito, essa caracterização foi feita de modo bem bem refinado, né? Ah, só para vocês terem uma noção da complexidade do experimento e da qualidade e de controle da expressão que a gente consegue chegar. A gente tem aqui a os tratamentos começando a aos 7 dias e meio do zomento embrionário, né, nas fêmeas grávidas. E aí algumas fêmeas foram tratadas com 7

dias e meio mais 2 horas, outras com 7 Dias e meio mais 4 horas. assim sucessivamente, eh, numa janela que durou basicamente, eh, 24 horas. Então, cada pontinho desse fêmea grávida, uma ou mais, na verdade, né? Na maior parte das vezes até mais de uma, que recebeu uma injeção de tomoxifendo, né? Uma única dose de tomoxfendo. E e se esse transgênico tiver um bom comportamento, um comportamento tá sendo bem regulado, o que que a gente vai eh reparar? A gente vai reparar que nas injeções que é Que foram muito precoces, foram muito cedos, a gente

tem muitas células sendo recombinadas, né? Os seus descendentes vão ser o AFP. E nas a injeções foram mais tardias, eu vou ter um domínio menorzinho, porque justamente todo esse outro desenvolvimento aquele já ocorreu, ocorre aí entre o dia 7:30 e e 8:30, tá bom? Então, repara que conforme eu vou eh tratando aquelas fêmeas em momentos, né, cada 2 horas mais tarde, eu vou andando um somito, isso que é bacana, Tá? Então, um somito a menos eh tá sendo marcado até chegar aqui no no último dia de de tratamento, no último ponto, né, de tratamento. E

esses embriões aqui, eles foram tratados até o dia 8,5 e foram coletados com 9 dias e meio. Então, todos os embriões aqui t mais ou menos 9 dias e meio de movimento. Quando o transgênico não é tratado, repara, eu não tenho sinal, mostrando que a minha CR R ela tá sendo muito bem controlada e isso permite que a gente faça outros Estudos, tá? OK. Legal, né, gente? Então, repara o poder que eu tenho ah para estudar função gênica em diferentes cenários. Eh, lembra que eu falei com vocês que o nosso cérebro, né, a nossa criatividade

ao limite? É, é esse tipo de de coisa que a gente pode fazer e muitas outras mais, na verdade, até mais mais complexas, mais refinadas. Bem, pessoal, agora a gente vai começar a falar de outra outra estratégia para fazer modpação genética, Né? No caso aqui, a gente vai eh falar do clássico que era utilizado para fazer animais knockout ah, ou noquins, a partir da produção de a partir de alterações direcionadas, né, target a modifications, ah, justamente em células troncoembrionárias. Então, repara o seguinte, eh, o uso de células troncoembrionárias limita muito qual tipo de organismo, qual

qual espécie que a gente vai usar, né? Eh, se Você trabalha com cégas, você não consegue isolar e crescer essas células e troncoembrionárias em cultura, pelo menos até onde eu saiba, onde eu tenho acompanhado. Só que agora com Crisper você não precisa fazer isso, né? Então, primeiro eu vou falar para vocês como é que era feito e depois eu vou falar para vocês do Crisp. E só que quando você trabalha com células embrionárias, você também tem uma outra questão que é uma Questão ética, né? Então, e estudos com células humanas não eram ou eram realizados

num período muito pequeno, muito limitado. Por quê? Porque você tá falando de um embrião [Música] humano. E sempre que você tá falando de célula embrionária, para você coletar essas células, você precisa a destruir o aquele embrião, né? Isso em camundongo e em rato, ah, é, é aceitável, né, eticamente Falando, e, e foi feito. E aí, uma vez que você isola essas células eh estaminais, essas células tronco, eh você consegue congelar e manter essas células ah preservadas para novos experimentos, tá bom? E por que que sala tronco? Por que que a gente usa a sala tronco

embrionável, né, a cala estaminal? Porque a gente precisa que elas sejam capazes de gerar todo o organismo, tá? Então, nesse caso Específico, a gente tá falando de células que vieram do embrioblasto, do ah da massa celular interna, né? Inner mass. E aí, para que a gente faça a cultura dessas células, a gente precisa do auxílio de outras células. Essas célas estão mais alongadas aqui. Essas outras células são chamadas de MEF. né, de mouse embryonic fibroblast. E por que disso? Se você pegar e lembrar a do desenvolvimento embrionário que a gente vê eh nas aulas de

embologia, quando a Gente tá naquela fase do trofoblasto, a gente, desculpa, na fase do blastocisto, a gente vai ter a o trofoblasto, como como eu falei, e na parte interna dele, a gente tem um grupo de células cúbicas que a gente chama de massa celular interna. Tá? Então a gente tá vendo aqui nesse desenho simples que eu fiz que tem uma cavidade, né? A blastocele, a massa celular interna essa regiãozinha aqui e aqui a gente tem um epitélio pavimentoso simples formando Trofoblástico. Essas células da massa celular interna essas células que a gente tá vendo aqui.

Essas são as células troncoembrionárias. E essas células epitheliais pavimentosas que a gente tá vendo aqui são esses fibroblastos foram isolados a de embrião de camundongo que servem como um suporte para que essa célula aqui não se diferencie precocemente, tá? Então, quando a gente trabalha em cultura de células, a gente tem um um medo, né, um Pânico que é ter contaminação, seja uma contaminação bacteriana, uma contaminação por fungo. Agora, se você trabalha com célula estaminal, você tem uma outra preocupação, é que esse grupo de células começa a se diferenciar. E aí, se esse grupo de células

começa a se diferenciar precocemente, o que que vai acontecer? a gente vai ter dificuldade de gerar o nosso animal numa etapa subsequente. Então, ah, considerando que, né, as condições de cultura estão Todas controladas, que as nossas células estão saudáveis, estão proliferando, a gente tá fazendo a passagem delas e a gente consegue manter essas colônias. Então, aqui, isso é importante mencionar também, né? Cada grupinho desses é uma colônia e é um, na verdade é uma célula tronco que gerou todas essas células que a gente tá vendo aqui. Aqui eu tenho uma outra célula tronco que gerou

essa colônia. Aqui do lado eu tenho uma outra também, tá bom? Então o que que a gente Faz? A gente tripsiniza essas células, eletropora com a nossa construção, a construção que a gente tá vendo aqui, tá? Repara que eu tenho aqui lox e e e frt. Ah, aqui eu tenho um gen de resistência para fazer a seleção, a seleção positiva. E isso é importante porque quando eu eletroporo as células tronco com a minha construção, classicamente, né, eu tô falando tudo isso como era feito algumas décadas atrás, essa eficiência era muito Baixa. 10 a 4, 10

a 6, dependendo da constão até 10 a7. Então era muito pouco provável que a gente conseguisse ter uma célula com a nossa recuperação de interesse. Então eu precisava de uma célula que de rápida proliferação, que no caso aqui eu tenho três células que foram geneticamente modificadas, tá? Quando eu faço tratamento com um antibiótico, no caso aqui o neumicina, a essas células que não receberam a construção vão vão Morrer. E aí essas células proliferam, crescem e formam colônias. E aí a partir disso, dessas colônias, eu faço um screen, identifico que tá tudo certo, né? Antigamente era

feito com saldo em blot, uma técnica relativamente ah a ah trabalhosa de de fazer, mas uma vez que você consegue checar que a integração do da sua construção foi feita, né, por recombinação mó, tá vendo esse X aqui no local certo, no local esperado, com uma única cópia, aí você Pode isolar o teu clone, né, positivo e injetar num outro blas. Cisto. E a gente tá vendo essas células aqui roxinhas, geneticamente modificadas, eh, em conjunto com células brancas que não foram geneticamente modificadas. Então, isso vai levar, e a gente tá vendo aqui no cantinho, desculpa

aqui o meu vídeo que tá em cima, mas a gente tá vendo aqui justamente a injeção dessas células para gerar a produção de uma quimera. Que que é uma quimera? É uma mistura. Eu Tenho células que são gerente modificadas e células que não são que não foram gerentamente modificadas. E isso vai eh no caso, e isso é muito legal de mencionar, eh a gente utiliza uma estratégia ah de diferentes cepas de células. Então, essas célas vão produzir uma cor de pelo marrom, essas celas brancas vão produzir uma cor de pelo branquinha. E aí, se eu

tiver uma quimera onde eu tenho grandes e tufos de Pelos marrom, sugere que parte dessas células também chegou na linhagem germinativa. Então, eu pego esse animal, né, ele vai nascer, vai crescer. Ah, a gente vai fazer alguns screenss, né, neles para para ter certeza que a recombinação aconteceu, mas a gente não sabe ainda se ele é capaz de passar aquela modificação para ali germinativa. E aí o que que a gente precisa fazer? Cruzar com o animal Y type. E aí se tiver ocorrido essa passagem para linha Germinativa, a gente vai ter um animal heterozigoto normalmente,

né? Porque é muito raro a recombinação. A gente vai ter um animalzigoto com a com a pelagem eh toda marrom. Bacana. Só que esse animal macho ou fêmea, aí ele normalmente a gente vai ter um só, tá? Então a gente pega esse animal, cruza com outro type. E aí agora, né, por herança mendeliana, se esse aqui for macho, até é mais interessante, porque aí você pode usar com duas, três ou mais Fêmeas. E aí você pega o os filhotes dessa, né? Então, esse aqui é o F0, o F1, esse aqui o F2. A gente pega

e os filhotes desse desse cruzamento e aí cruza entre eles para gerar o animal. Nesse caso aqui a gente tá vendo, ó, hetterosigoto aqui tá encoberto, a gente vai ter um animal é nocout, tá bom? Então, repara que eu tenho muitos cruzamentos para chegar no meu animal nocout e obviamente isso tudo demora. Então, se a gente pegar o tempo para Fazer eh um animal nocout por recombinação homóloga, a gente tá falando aí aproximadamente em torno de 2 anos, se tudo correr muito bem, né? Se tiver algum problema, isso pode virar 4 anos. Se você tá

fazendo o teu doutoramento, não é o trabalho que você gostaria de fazer, porque você não vai ter tempo de fazer mais nada depois disso. É, e apesar de ser muito poderosa, né, uma ferramenta que foi utilizada para gerar, enfim, muitas Linhagens, muitas, até algumas estão congeladas e a gente ainda não sabe o fenótipo, eh, né, em vários bancos de de embriões, mas, eh, enfim, eh, muita das coisas que a gente conhece hoje foram feitas com essa estratégia. Eh, só que isso demora muito. Então, como é que a gente faz? E, e nota, gente, desculpa, tá?

Eu eu tive a eu simplifiquei muito, né, o o detalhamento da da produção de animais geneticamente modificados por Recomendação homóloga, justamente porque hoje em dia a gente tem o Crisper e o Crisper basicamente e e eu vou mostrar para vocês como isso foi feito. Ele basicamente acelera muito esse processo. Então, se antigamente eu demorava 2 anos, 3 anos para fazer, hoje eu consigo fazer em 3 meses, 6 meses, dependendo aí da complexidade, tá bom? Então eu trouxe para vocês essa essa transição aqui, né, esse keep common crisper on, justamente porque ele facilita muito a nossa

a Nossa vida no laboratório. E aí, gente, o Crisper é nada mais nada menos que um sistema imuneadaptativo de bactéria. Se você for imunologista, você vai achar essa expressão, né, essa frase que eu falei muito bizarra, porque a gente aprende na imunologia que o sistema é adaptativo é baseado em célula. E no caso de bactéria a gente tá falando de um seu unicelular, tá? Por que que ele é chamado sistema Imunoadaptativo em bactéria? porque ele é capaz de lembrar ah encontros anteriores com bacteriófagos. E aí ele guarda um pedacinho desse DNA bacteriófago para num eventual

segundo encontro ele produzir uma resposta imune e aí eh combater aquela infecção com mais com mais eficiência, com mais rapidez, tá bom? Então o Crisper foi identificado em bactéria e foi adaptado para sua utilização como uma ferramenta de edição gênica em células Eucarióticas. Ah, como é que como é que isso acontece em bactéria? Então aqui eu tenho a minha primeira infecção eh com esse vírus bacteriófilo. E esse esse elemento ele vai ser processado por algumas enzimas ah da família CAS. E com isso, né, essa bactéria sobreviver a infecção, a gente vai ter a adição de

uma pequena sequência eh desse bacteriófago num locus que a gente chama de locus crisper. E aí, repara aqui que cada cor representa um encontro com Algum tipo de bacteriófago específico, tá? Então, repara que eu tenho uma repetição, esse losango preto e aí eu tenho essa sequência específica do meu encontro prévio com o bacteriófago. Essa é o que a gente chama de aquisição, é a fase de aquisição. No caso de uma segunda infecção ah, com o mesmo bacteriófago, o que que vai acontecer? Esse locus crisper vai ser expresso. E aí, repara que ele ele é grande,

né? Ei, quanto maior, mais Energia gasta, né, para fazer essa transcrição, essa essa essa expressão do que a gente chama de pré eh eh pré-cr, esse esse esse pré CRNA vai tem várias alças e depois ele vai ser civado formando o CRN ou RNAs, tem gente que chama de RNA guia também, tá? Eh, maduros. E aí, por que que chamo de RNA guia? Porque agora eu tenho uma sequência específica ah daquele encontro prévio, né, do bacteriófago prévio, a sequência Azulzinha. E aí, por complementaridade de Creek vai reconhecer o meu DNA viral do bacteriófago. E aí

eu tenho uma outra enzima que nesse caso aqui é a gente tem seis exemplos, a também da família Caj o a mais famosa, né, que todo mundo já deve ter ouvido falar, chama Caj Cajnine, Caj Cajn. Aí a enzima reconhece, né, ela vai ser levada ao DNA do bacteriófago, ela reconhece, né, essa esse RNA guia. E aí, no caso da CAR9, a gente tem uma quebra de fita Dupla, tá bom? Esse esse essa imagem aqui é de 2017, ela já tá um pouquinho desatualizada, a gente já conhece o mecanismo da da CSF1, tem alguns trabalhos

que usam, mas ainda hoje a gente tem muita gente usando a CASNO, que ela faz uma quebra de fita dupla, a cega, né? Aqui a gente tem outros mecanismos de CAS, quebrando fita simples, quebrando, né, cortando só de um lado aqui, fazendo uma quebra eh eh coesiva. Enfim, eh qual é a minha Recomendação? Depende do teu objetivo, depende do objetivo do teu projeto. Ah, aí você escolhe qual é, qual a melhor caixa para você. E aí uma outra um outro ponto importante a ser considerado é o tamanho da caixa, né? Lembra que eu falei de

delivery de DNA? Eh, no caso de retrovírus, adenovírus, a gente tem eh uma limitação de tamanho. Então, o ideal é que a gente encontre sequências de Caixa que sejam cada vez menores pra gente poder usar o O mecanismo viral para fazer a entrega desse desse material, tá bom? Mas se isso não for uma preocupação para você, você pode usar uma C eh Nine original e aí faz eletroporação, faz a a microiniação pronuclear. Vai funcionar muito bem. Foi o que foi o que eu fiz e mostrei para vocês lá no início, tá bom? Legal. Então, como

é que acontece a a crivagem do DNA? A gente tem aqui o o a dupla fita de DNA, aqui tá a sequência alvo e esse Tudo aqui a gente tem uma parte conservada que chama track RNA. Aí tem gente que chama isso tudo aqui de RNA guia, tem gente que faz uma distinção de nome. É importante que isso fique claro e na hora, né, do do artigo, na hora que você for escrever o teu trabalho, você eh defina bem o que que você tá chamando de RNA guia, a a se é só essa regiãozinha que

você fez por bioinformática ou ou se é toda molécula, tá bom? E aí essa molécula, ela vai ser Reconhecida pela enzima e a gente tem, né, pela, no caso aqui a carne. E a gente tem aqui então uma sequência azulzinha destacada que a gente chama de motivo adjacente ao prótespaçador, é ou pan. E aí a gente tem então contando a partir desse desse pan, a gente tem 1 2 3 4. Entre a terceira e a quarta base a gente vai ter a a quebra a double strake, né? A quebra de fita dupla. A gente tem

aqui dois domínios específicos, cada uma vai quebrar uma Fita. No caso, RVC quebra do, né, na leitura cinco linha, três linha e o o HNH que vai quebrar três linhas, cinco linha, tá bom? Por que que eu tô falando isso? Porque a gente pode fazer algumas mutações na CAS9 e eh tornar ela menos tóxica ou ou enfim, eh ou mesmo inativar essa clivagem para fazer outras coisas depois. Tá bom? Tô falando demais, né, gente? Eu imagino que vocês devem estar um pouco cansados. Eu vou dar uma aceleradinha e a gente Termina daqui a pouquinho. Então,

ah, você tem a sua célula que você quer modificar, você fez a o teu RNA guia de interesse e aí ele vai reconhecer o teu DNA alvo. E basicamente o que que o sistema faz? Ele basicamente faz uma quebra de fita dupla, no caso da CAR9, tá? O que vai acontecer depois depende. Se a gente não fizer nada, e eu tô pegando aqui um exemplo simples de uma célula, se a gente não fizer nada Com aquele com aquela célula, a própria maquinaria da célula, maquinaria proteica da célula, vai tentar reparar essa quebra de fita dupla

por uma estratégia que a gente chama de junção de extremidades não homólogas, NH e AJ, tá? Só que esse mecanismo e tem alguns algumas variações, mas esse mecanismo ele ele não é 100%, né, eficiente. E aí ele pode fazer alguns errinhos. Esses errinhos normalmente levam a pequenas Inserções de nucleotídios ou a pequenas deleções, o que a gente chama de indels, tá? Se eu tenho uma deleção, por exemplo, ah, de números que não são múltiplos de três, então deletei um um nucleotídeio 2, 4 5, a gente vai ter o que a gente chama de mudança de

frame de leitura, o que pode levar a uma proteína troncada, tá? Agora, se depois dessa quebra de fita dupla, eu forneço um molde de DNA que tem braços de homologia, eu posso Induzir um mecanismo que a gente chama de eh recombinação dirigida por homologia ou HDR, né? Molo driven recombination. E aí com isso eu consigo inserir ah algo de interesse naquela região. Então repara, se a gente pensar na recomendação homóloga que eu falei para vocês há um pouco tempo atrás, que isso aqui é bem parecido. A grande diferença é essa etapa aqui que eu tô

induzindo a quebra de fita dupla. Então como eu tô induzindo essa quebra na fita Do DNA, eu aumento a minha eficiência. Eu tô estimulando a célula a fazer recomendação ao móvel. E isso é bacana. Por quê? Porque como eu tô aumentando a minha taxa de recomendação, eu já não preciso de tanta célula. De vez eu eh trabalhar com célula tronco, célula tronco, né? Célula troncoonária, eu posso trabalhar com uma célula regular, posso trabalhar com hepatócito, posso trabalhar com fibroblástico, enfim, eu posso trabalhar Com outros organismos, tá bom? Então esse foi um ganho eh muito interessante,

muito grande da dessa ferramenta, né, do Crisper que trouxe pra gente. E aí tem, enfim, tem alguns exemplos aqui mostrando o uso de Crisper ah em embriões de peixe. Nesse caso aqui, o Crisper tá sendo entregue por microinjeção. Ah, e aí a gente tem também a formação de quimera, tá? aqui bem bonitinho. A gente tem, né, algumas salas vermelhinhas, ah, que Sofreram [Música] ah, desculpa, gente, que, né, que trazem um repórter para mostrar que que teve a recomendação bem sucedida. Ah, aqui um outro exemplo de Crisper, esse aqui é bem legal, ah, feito em peixe,

que é um reparo que é independente de homologia. Então, eu não tenho os braços de homologia. O que eu tenho é um plasmídio com a região ah do alvo, né, do meu RNA guia. Eu tenho aqui uma sequência de um Peptídeo que salta cliva, um peptídeo 2A e aqui o meu G de interesse. Então repara só, eu forneço a minha proteína, pode ser proteína, pode ser o RNA mensageiro que vai codificar proteína, eu forneço meu RNA guia. E aí, por o meu RNA guia vai reconhecer o o, né, aqui o pan? Então, ó, 1 2

3 4, ele vai civar justamente nessa região. Isso aqui vai linearizar o plasmídio e e foi observado que ao fazer isso, a gente vai ter a integração dessa região no nosso locos De interesse, tá bom? Então eu tenho um eu tenho um reparo que não depende de braço de homologia e isso quando eu tenho muitos embrones, que é o caso de grafista, isso fica bastante interessante ah pra gente eh fazer screening e fazer a seleção ah da offspring. Tá bom? Aqui eu tenho um outro exemplo mostrando que eu posso usar o sistema crisper para fazer

uma uma induzir uma quebra eh na região do gen e aí eu consigo eh incluir um Repórter, né, aqui um repórter azul e aí as células ficam com o núcleo azul ou ele pode estar aqui com uma integração reversa e a gente consegue utilizando primers para fazer a a seleção dessas células a de forma aí bastante eficiente, tá? Eu tô sendo um pouco eh simplista na minha explicação, mas é a ideia aqui principal, gente, é só para vocês verem as as várias aplicações possíveis, tá? Então, repara que isso aqui é um exemplo feito por reparo

Independente de homologia, tá bom? Bacana, né? Então eu a minha ideia aqui é que a gente faça um experimento Crisper, ah teórico prático, né? não vai ser prático pra gente tá numa aula gravada, mas tentando simular as etapas necessárias para fazer crisper na com células. E aí você pode tentar fazer isso no seu laboratório, tá? Então, a primeira coisa é você definir o seu gen de interesse. E aí tem uma série de ferramentas que fazem a seleção eh da Sua sequência guia, tá? Então aqui eu tenho em verde eu tenho o pan e aqui tem

vários eh candidatos, né? Essa é uma ferramenta que foi eh descontinuada, mas enfim, é basicamente todas as outras derivadas novas, elas utilizam os mesmos algoritmos para fazer esses cálculos ou algumas pequenas variações, tá? Então, ah, de modo geral, quando você quer fazer uma inativação de um gênio, eh, o ideal é que você procure a fazer essa essa quebra de fita dupla no primeiro Exel. Por quê? Porque aí você vai induzir uma mudança do frame e tudo que vier depois e tem chance de ter stop colos prematuros e aí você vai ter uma proteína troncada eh

não funcional, tá bom? Legal. Então aqui nesse caso aqui e eu trouxe um exemplo de uma estratégia baseada em plasmídio. A a gente faz a clonagem do RNA guia nessa regiãozinha aqui. Tem todos os outros elementos K9 FP para fazer a seleção, para fazer a indução e depois a Seleção. Então aqui tem um um grupo de células, né, musculares. Você faz a eletroporação aqui usando um sistema diferente chamado núcleo faction, mas enfim, poderia ser qualquer sistema de eletroporação. Aí essas células que recebem um plasmídeo, eles vão vão ficar verdes, tá? Então a gente consegue enriquecer

somente as células que receberam plasmídio e as outras a gente descarta, faz uma diluição limitante para pegar uma célula por Poço. Essas células elas são capazes de de proliferar e se expandir. E aí eu consigo, né, fazendo replicação desses poços, eu congelo uma parte, outra parte eu faço extração de de DNA genômica. que aí eu posso fazer de notagem com PCR e sequenciamento, tá bom? Óbvio que isso aqui também foi bastante rápido e simplificado, mas é só para vocês terem uma ideia geral da da complexidade e na verdade até da simplicidade que é feito hoje

em dia pra gente ter a Identificação de células mutantes. Então repara só, na nucleofecção eu tenho algumas células só que vão receber o plasmídia, as outras não vão receber. Aí, após o o sorting, eu consigo enriquecer somente paraas células verdes, que esse bromasmídio. Mas aí o que que acontece? Essas corezinhas nesse X que vocês estão vendo aqui, nem todas as células eh vão ter a quebra de fita dupla. Algumas vão ter nos dois alelos, Outras vão ter em um alelo apenas. Então, a gente precisa fazer a genotipágina. Algumas vão conseguir reparar o DNA e aí

a gente não vai ter nenhuma mutação, vai ser o Y type porque a maquinaria de DNA foi bem sucedida, outras vão ter pequenas alterações, por isso é importante a gente sequenciar também, tá? E aí quando a gente sequencia, a gente consegue ver, por exemplo, nesse caso aqui, é um manuscrito que tá quase pronto para ser Submetido, que a gente teve uma deleção de quatro nucleotídios. E aí, obviamente, né, não é múltiplo de três, a gente vai ter uma mudança do frame de leitura e com isso a gente consegue eh eh caracterizar, estudar essa célula mutante.

No caso aqui um exemplo para um receptor, é um outro receptor de TGF beta orc, tá? Aqui são estudos preliminares, a gente já tem outros números, né, mostrando que as células Mutantes para ALC 4 t a dificuldade para se diferenciarem. Então se aqui a célula White Type, quando ela é tratada com um outro ligante da superfília, né, que chama GDF1, o GDF11 é tardea e diferenciação das células musculares. Quando você inativa o qu, você também retarda a diferenciação das células musculares quando você tem uma célula que é alco 4 mutante e ainda assim você trata

ela com DDF11, esse efeito ainda é mais forte. Muito bacana, né? Legal. E aí, gente, a gente pode eh usar crisper, né? Como a gente não depende mais de célula tronco, a gente pode usar crisper para inativar, enfim, eh inativar não, né? Para modificar qualquer tipo de célula. E hoje em dia já tem ensaio clínico ah a ah com pacientes que têm distrofia muscular de duchem. Então esses pacientes eles têm uma inflamação crônica no músculo que vai levando a meusaustão de célula tronco e eventualmente essas células eh Passam, né, acabam não conseguindo reparar as lesões

musculares que são formadas. Por quê? Porque a a distrofina mutante, ela se rompe com facilidade. Então, a gente vai ter rompimento da dessa ligação eh do citoplasma da célula com a matriz celular, tá? E aí isso acaba levando a a ruptura aqui de membrana, um e um esgotamento dessas células tronco. Essa tem uma discussão se essas células troncos são esgotadas ou não. Eu não vou Entrar no mérito aqui, mas isso leva uma série de fenótipos. Aqui tem uma lista, né, desses fenótipos. Eh, dependendo, né, na verdade, na verdade, com um tempo, conforme esse paciente vai

envelhecendo, ele eh outros músculos são afetados e isso, eh, de modo geral é uma densção muito grave e evolui para óbito, tá? Então, o que tem sido feito aqui? A gente tá vendo um exemplo da histologia, né, com com necrose e inflamação crônica. A algumas células normais e outras, né, outras regiões já não funcionais. E e aí o que que foi feito? Até usando aquela aquela C a CPF1, eh a gente consegue induzir a o que a gente chama de action skipping, né? através de através do Crisper, a gente consegue pular os stop prematuros e

aí a gente vai ter eh ou a correção do, né, tirando a remoção do stop, né, o reframing, ou a gente tem o Que a gente chama de exon skipping aqui. E aí você vai ter outras isoformas da distrofina, mas agora a iso funcionais. Então isso foi feito em cabundongo e também em em cachô. Ah, e aí quando isso é feito num modelo, né, que tem a mutação para distrofina, é, é possível corrigir essa aqui, tá a mutação, né, da que leva o stop prematuro e aí você usando o crisper você consegue corrigir essa mutação.

E Aí a gente tem uma situação aqui no camongo MDX, aqui o MDX corrigido. E aí quando você faz uma imunomarcação pra distrofina, a gente percebe que agora ela tá presente no aqui em dois tipos de músculo, né? O tibialise anterior. Ah, e a gente vê que que a a você recupera a disfrofina, você recupera a função e com isso o animal ele vai ter um prognóstico aí bastante favorável. Legal, né? E e agora, gente, eu sei que vocês já estão cansados, a aula já tá terminando, ela é Muito extensa, tem muita coisa legal para

falar, na verdade, que eu peço até desculpa, né, porque eu acabei omitindo aí muita coisa recente, bacana, né? A gente hoje em dia tem e usado, tem crisper ensai clínico, vocês já devem ter vistos para tratamento de anemia falsiforme. A a então assim, cada semana tem uma novidade basicamente. Mas eu o que eu quis fazer para vocês é que agora já vai fazer 10 anos, né? Mas, mas há há pouco Tempo atrás e esse autor, né, o Arário, eu imagino que vocês já devem ter ouvido falar dele, eh ele escreveu que a gente ainda tava

muito longe de ter, né, estamos muito distantes de ter bebês geneticamente modificados. E e na verdade ele errou, porque há dois anos depois a gente teve um caso, né, na China desse cientista que divulgou que ele produziu eh na época ele divulgou dois, depois saiu um terceiro, né, a bebês que foram geneticamente Modificados para ah esse receptor, né, o CCR5, que eh que a gente sabe que ele é importante para como rota de entrada na célula do do vírus do HIV. Então, a a o que ele pensou foi de fazer a humanos resistentes à infecção

por HIV. Óbvio que isso contornou uma série de legislações e e autorizações. Ah, foi foi um escândalo. Eu imagino que vocês devem ter ouvido falar dessa notícia. Eh, ele acabou bem, foi na China, né? Então ele acabou, a gente acabou não tendo muitas notícias dele. Aí parece que disseram que ele foi preso, depois parece que ele foi solto, mas ele já não tem autorização para fazer pesquisa. Aí eu vou ser sincero com vocês, eu acabei não acompanhando, tá, eh, a história. Mas o ponto importante é que, eh, tecnicamente hoje a gente já tem as ferramentas

Necessárias para fazer o humano geneticamente modificá-las. O que impede da gente fazer é a a consciência e as questões éticas, mas a a as ferramentas existem e os desafios, né, tem outros desafios que também existem. O principal, né, e que é uma grande discussão, é a entrega desse material, né, a entrega dessas desses elementos que vão fazer a recombinação. Por que que eu tô falando isso? Nesse caso aqui, eh, foi feito com embriões e Aí todas as células do embriões vão ser geneticamente modificadas. Isso pode ter um impacto até na evolução da nossa espécie. Mas

eu posso usar Crisper e isso já tem sido feito, né, como eu falei para vocês, com as autorizações, com as etapas todas sendo seguidas, ah, em células somáticas. Então, né, o o grupo de células mais fácil da gente acessar e fazer isso são as células sanguíneas. Tá bom? Só elas troncoatopoéticas, por exemplo. Então, a Grande pergunta que eu deixo para vocês, pra gente terminar essa aula, que eu sei que foi um pouquinho longa, é para onde a gente tá indo, né? Eu eu imagino, eu acredito é que a gente tá indo aí para para um

para um futuro bem interessante, bem promissor, mas ao mesmo tempo que a gente tem que ser muito cauteloso com esses desvios éticos e, enfim, né, a a essas considerações que são eh bastante bastante relevantes e bastante delicadas, tá? E aí eu deixo essa Provocação. Se você gostou, né, de desse desses assuntos, né, tem muita coisa legal. Eh, o meu e-mail tá lá no início, se vocês quiserem entrar em contato, vai ser um prazer responder para vocês. E eu queria agradecer, né, a atenção aí nesse período aí que eu acho que falei, acabei falando um pouquinho

demais, tá bom? Um grande abraço, sucesso para vocês no curso e até a próxima. M.