XXI Curso de Verão em Bioquímica e Biologia Molecular - IQ/USP

Pessoal, sejam muito bem-vindas e bem-vindos  ao 21º curso de verão em Bioquímica e Biologia   Molecular do Instituto de Química da Universidade  de São Paulo. Meu nome é Penélope Valente,   eu sou aluna de doutorado e vou acompanhar vocês  durante essa jornada. Quero começar falando sobre   o laboratório de estabilidade genômica, que é  onde eu faço o meu doutorado sobre as orientações   do professor Nicolas Hoch.

trouxe para vocês  algumas imagens dos meus colegas de laboratório   em momentos de descontração, não em momentos de  trabalho, porque a gente trabalha bastante, mas a   gente também sabe se divertir. Nesse laboratório,  a gente investiga uma modificação pós-traducional   chamada de ADP e riboilação. Modificações  pós-traducionais são aquelas que ocorrem nas   proteínas depois que elas são traduzidas.

A mais  famosa de todas, que com certeza vocês já ouviram   falar, é a fosforilação. Existem várias outras,  inclusive a ADP ribosilação. Nesse laboratório   a gente tem algumas linhas de pesquisa,  como a autofagia mediada por chaperonas, a   ADP ribosilação no contexto da resposta interferon  a patógenos virais e especialmente coronavírus.  

Quais são as consequências moleculares  de mutações em genes de reparo de DNA   que ocorre em doenças genéticas humanas,  e a linha de pesquisa mais legal de todas,   que investiga os mecanismos moleculares da morte  celular induzida pela hiperatividade de PARP1,   que é o meu projeto de doutorado. Eu  vou falar um pouquinho para vocês agora,   mas se vocês tiverem interesse em saber mais sobre  o professor Nicolas, sobre as outras linhas de   pesquisa ou sobre qualquer coisa relacionada  ao laboratório, por favor escaneie QR code   que vocês estão vendo aí, que vai levar vocês  direto pra página do laboratório na internet.   No meu doutorado, eu busquei investigar quais  são os genes que regulam a via de morte celular   chamada PARthanatos.

Para falar de PARhtanatos, a  gente tem que falar um pouquinho sobre a PARP1. A   PARP1 é uma enzima que catalisa a ADP ribosilação,  ela catalisa essa modificação pós-traducional que   eu acabei de falar para vocês e ela tá envolvida  no reparo de danos ao DNA. Então, quando o DNA ele   é lesionado, a PARP1 é recrutada ao local do dano  e sinaliza para que a maquinaria de reparo venha   e repare essa lesão.

De que forma que ela vai  sinalizar isso pra maquinaria de reparo? Através   da ADP ribosilação das proteínas envolvidas  que das proteínas no entorno dessa lesão,   especialmente as histonas e também ela mesma.  Pois bem, mas dependendo do tipo de dano ou da   intensidade com a qual esse dano acontece, a PARP1  também sinaliza para a morte celular.

Então ela   é recrutada ao local do dano, ela modifica as  proteínas ao redor desse dano e a partir desse   ponto não há um consenso na literatura sobre como  PARthanatos ocorre. A gente sabe que a célula   morre e que a morte dependente da hiperativação  da PARP1, mas quais são os mecanismos moleculares,   quais são as etapas, quais são as proteínas  envolvidas nessa morte? Não se tem um consenso.  

E é nesse cenário que entra o meu projeto. No meu  projeto, eu fiz um CRISPR screen de todo o genoma   para tentar identificar quais são esses genes que  estão regulando a morte celular por PARthanatos.   Antes de falar do que eu fiz, eu quero falar para  vocês o que que é um CRISPR na natureza.

O CRISPR   nada mais é do que um sistema de defesa  das bactérias. É um sistema adaptativo de   defesa das bactérias. No genoma das bactérias, a  gente encontra genes correspondente às proteínas   chamadas Cas, que são endonucleases, ou seja,  são enzimas que vão clivar material genético,   vão clivar o DNA.

E logo próximo dessas sequências  de genes Cas, existem sequências repetitivas,   que a gente chama de R, intercaladas de sequências  S espaçadoras. Bom, quando então um bacteriófago   invade uma bactéria, o sistema Cas reconhece  esse DNA como sendo um DNA invasor e o incorpora   em seu próprio genoma, não de forma aleatória,  incorpora nessas sequências espaçadoras S que eu   acabei de falar para vocês, que ficam justamente  ao lado dessas sequências repetitivas. A bactéria,   quando ela vai transcrever essas sequências, ela  faz juntamente com as a sequência das proteínas   Cas.

Desta forma, ela produz ribonucleoproteínas  que ficam vigilantes por essa célula bacteriana.   Quando essa estrutura ribunucucleoproteica,  ela encontra um DNA invasor, esse sistema de   vigilância consegue destruir esse DNA invasor.  Como é que ele reconhece e destrói ?

o RNA   consegue parear e reconhecer esse DNA invasor e  a Cas9 vai fazer o que ela sabe fazer porque ela   é uma endonuclease, vai clivar esse material  genético. Então dessa forma destruindo desse   sistema de defesa das bactérias, desenvolveu-se  então o CRISPR como ferramenta de engenharia   genética. Quem conseguiu fazer esse pulo  do gato foram essas duas pesquisadoras,   a Emmanuel Charpentier, que é essa morena,  e a Jennifer Doudna, essa loira, que foram   agraciadas com um prêmio Nobel, justamente por  conseguir revolucionar a biologia molecular, a   engenharia genética de forma a escalonar, baratear  e também facilitar a vida dos biólogos moleculares   que querem editar o genoma.

Bom, eu falei que  eu fiz um CRISPR screen de todo o genoma. Eu   tenho que agradecer à Universidade de Cambridge  para onde eu fui fazer esse experimento. E eu   tive a grande oportunidade de ver uma palestra da  Jennifer Doudna e tá aí uma fotinho minha com ela   que eu tenho muito orgulho de mostrar para todo  mundo.

Pois bem, vamos voltar ao que interessa.   CRISPR como ferramenta de engenharia genética.  Esse sistema ele é composto por uma nuclease que   normalmente é Cas9, mas existem outras nucleases,  que vai clivar uma região específica do genoma e   de que forma ela vai conseguir clivar esse uma  região específica do genoma?

Como é que ela vai   saber aonde clivar no genoma? Porque ela vai  estar associada a um RNA guia. Esse RNA guia   ele vai interagir com a Cas9 e também com o DNA,  com a sequência de DNA que a gente quer editar.  

Hoje em dia é possível comprar bibliotecas prontas  de RNA guia. Você não precisa ficar desenhando RNA   guia por RNA guia por RNA guia. Você compra  bibliotecas prontas de RNA guia contra o seu   genes de interesse.

No caso do meu screen, do  meu CRISPR, eu usei uma biblioteca contra todos   os genes do genoma, de forma que eu consegui  nocautear todos os genes do genoma humano,   porém um único gene foi nocauteado por célula.  Quando você compra uma biblioteca dessas,   um dos primeiros passos necessários é produzir  uma biblioteca viral contendo seus RNAs guias.   Ou seja, você vai produzir vírus que tem  que cada vírus vai ter um único RNA guia.  

Antes de mais nada, a gente não trabalha em  laboratório com vírus inteiro. A gente trabalha   com plasmídios virais que vão fazer o vão fazer o  vírus apenas dentro das células modelo que a gente   usa para produzir vírus. Isso, isso é uma questão  de biossegurança.

Então, a gente vai transfectar   os plasmídios contendo as informações para  formar o vírus e o empacotamento dos RNAs guias   em células modelo. Em seguida, a gente vai fazer  a transdução e infectar as células de interesse   que a gente quer estudar. A gente tem que fazer  isso de modo que um único vírus infecte uma única   célula para que cada célula seja nocaute para  um único gene.

Eu não quero células com dois   nocoutes, com dois genes nocauteados. Eu quero  um gene nocauteado por célula. Então o vírus   vai fazer o que ele sabe fazer de melhor, que  é infectar as células e transmitindo para cada   célula esse RNA guia que vai então fazer o nocaute  na célula.

Com isso, eu vou chegar a uma população   final heterogênea da célula de interesse que eu  quero estudar, na qual todos os genes do genoma   estão nocauteados, porém um único gene por célula  está nocauteado. Essa população heterogênea,   ela é então submetida a uma pressão seletiva que  pode enriquecer ou depletar as células. No caso   do meu screen, a pressão seletiva que eu utilizei  foi uma pressão seletiva para induzir PARthanatos,   ou seja, eu induzi a morte celular nessas células. 

As células que receberam um RNA guia importante   para PARthanatos foram enriquecidas, ou seja,  elas conseguiram sobreviver. Por quê? Porque eu   nocauteei um gene que é importante para que a  célula morra.

Então ela não conseguiu morrer.   Basicamente foi isso. Depois que a gente faz  essa pressão seletiva e consegue enriquecer   as células de interesse, chega a etapa final, que  é extrair o DNA e purificar o DNA dessas células,   amplificar por PCR e mandar para sequenciamento  para poder saber quais foram os genes que   provocaram a resistência dessas células.

Gente,  eu não quero tomar muito tempo de vocês. Eu quero   agradecer a presença de vocês aqui no curso  de verão. Tô muito ansiosa pra gente poder   conversar mais.

A gente vai ter dois momentos  hoje. Um momento às 9 horas de apresentação e   o outro momento às 15 horas para poder discutir o  que vocês quiserem discutir. Façam as atividades   e quem tiver mais interesse sobre PARthanatos,  CRISPR conversar.

Tá bom? Tem aí o meu Instagram   @Pvalente, quem quiser mandar mensagem pode  mandar mensagem, a gente vai conversando.   Tá aí de novo um QRcode que leva pro site do  laboratório.

Se vocês perderam antes do QR code,   mas se interessaram agora, aproveita e escaneia,  tá bom, gente? Vejo vocês. Até mais.

Bons estudos.