Aula #4 - Proteínas: Reações de Caracterização e Precipitação

o Olá pessoal na aula de hoje nós vamos falar sobre caracterização de proteínas vocês vão ver algumas reações de coloração para detecção de proteínas em solução e Nós também vamos ver algumas condições que promovem a desnaturação Ea precipitação de proteínas como sempre haverão algumas intervenções teóricas entre Os experimentos não esqueçam de fazer as suas anotações e acompanhar os protocolos dos experimentos no material didático e uma boa aula para todos E aí é muito bem nessa primeira parte da aula nós vamos falar sobre reações de coloração para detecção de proteínas em solução nós vamos ver duas

reações diferentes uma conhecida como a reação da Neblina e a outra conhecida como a reação do biureto Então vamos começar pela reação da Neblina essa reação leva este nome devido ao composto neblina que utilizado para detectar grupamentos aminos em qualquer tipo de molécula incluindo aminoácidos oligopeptídeos e proteína nessa reação química que depende de temperatura para acontecer a neblina na presença de grupamentos aminos vai sofrer uma reação de condensação para formar um composto de coloração púrpura portanto se uma substância é positiva para a relação com neblina significa que ela contém grupamento Amino já reação do biureto

não é uma reação química propriamente dita o reativo de biureto nada mais é do que sulfato de cobre dissolvido numa solução aquosa com alto PH ou seja uma solução alcalina e nessas condições de alcalinidade o nitrogênio da ligação peptídica entre os aminoácidos que formam a proteína assumir a sua forma de se tô tô nada e portanto fica com um par de elétrons livres que pode se complexar com os fios de cobre que serão liberados na solução pelo reativo do Rio Preto para que esse complexo seja formado são necessárias 4 ligações coordenadas entre o íon cobre

e os nitrogênio das ligações peptídicas dessa forma a reação do biureto só será positiva Caso esteja presente na solução peptídeos com três ou mais aminoácidos Ou seja que tenham pelo menos duas ligações peptídicas cada um então vamos ver na prática como é que funciona o essas duas reações de coloração de proteínas acompanha o primeiro experimento muito bem pessoal então agora a gente vai ver as nossas duas reações de coloração de proteínas nós vamos começar pela reação da minha prima tá então nós vamos pegar esse tubo 1 e aqui nós vamos adicionar 5 gotas de solução

de proteína 10 porcento hoje é de 2 ml de solução de neblina vou tomar um é muito bem adicionados os regentes vocês podem ver que a solução é transparente esse tubo agora vai a 100 graus por cinco minutos ok então vamos lá colocar a 100 graus Então vamos colocar nosso tubo 1 me esquentar tu vai ficar aí cinco minutos a 100 graus é muito bem pessoal passado cinco minutos vamos tirar o tubo 1 se você já podem ver vamos voltar lá para bancada bom então pessoal depois de cinco minutos a 100 graus você já puderam

perceber que a neblina reagiu com as proteínas né com os grupos Amino das proteínas presentes na solução e deu esse composto de Cor Púrpura portanto essa aqui é uma reação positiva para neblina Ok Lembrando que a neblina não é específica para proteínas ela detecta agrupamentos Amino uma vez que proteínas tem grupamento Amino ela vai dar positivo é a segunda reação de coloração que nós vamos ver a reação do biureto então para isso nós vamos usar dois tubos tubo 2 e tudo três no tubo 2 nós vamos colocar um ml de proteína 10 por cento e

um ml do reativo do biureto e no tubo 3 vamos colocar apenas um ml de água e um ml do reativo de biureto portanto no tubo 3 não vai ter proteína vamos ver qual que é o resultado para esses dois todos E aí E aí E aí em pó adicionado os componentes tubo 2 tem proteína e direto no tubo 3 tem apenas água e violento então como vocês podem ver a diferença de cores entre o tubo 2 que é esse que está mais roxinho e o tubo 3 que se escutar mais azulzinho tá como eu

falei para vocês o reativo de Violetta é uma solução de sulfato de cobre sulfato de cobre ele é naturalmente Azul então a única coisa que nós fizemos aqui foi diluiu sulfato de cobre em água lá por isso que ele ficou azulzinho assim então esse aqui seria o nosso resultado negativo como não temos proteínas aqui você tem o resultado negativo o Resultado positivo está aqui ó então o biureto neozinho de cobre que estão no violento reconheceram os nitrogênios das ligações peptídicas significa que aqui deu uma reação Positivo tá significa que nessa solução de proteína 10 por

cento nós temos peptídeos com pelo menos três aminoácidos ou mais ou seja apetite há pelo menos duas ligações peptídicas por isso como vocês viram Em ambos os casos tanto na reação da Neblina quanto na reação do biureto as reações positivas Ou seja que dizem que a proteína na solução se dão pela mudança de coloração no tubo seja pela formação de um composto de Cor Púrpura no caso da Neblina seja pela complexação dos íons de cobre no caso do reativo de biureto é importante reforçar algumas diferenças entre essas duas formas de detecção de proteínas primeiro com

relação a reação da Neblina trata-se de uma reação química ou seja existe mudança dos reagentes para formar diferentes produtos essa reação precisa de energia térmica calor para acontecer e não é uma reação específica para detectar proteínas uma vez que ela detecta qualquer substância que tem a grupamento Amino incluindo aminoácidos peptídeos e proteínas o Joelson do biureto por não se tratar de uma reação química e sim de uma complexação pode ocorrer em temperatura ambiente não existe modificação entre reagentes e nem formação de Novos Produtos e é uma reação específica para proteínas ou pelo menos para peptídeos

com mais de três aminoácidos uma vez que os fios de cobre apenas formaram os complexos com as ligações peptídicas Caso haja peptídeos com duas ou mais ligações peptídicas presentes na mostra portanto a reação do biureto é mais específica para proteínas do que a reação da neblina que detecta como já vimos qualquer substância que tem a grupamento Amino agora que você já viram as reações de caracterização de proteínas por reações de cor nós vamos falar sobre reações de desnaturação e precipitação de proteínas primeiro importante fazer uma distinção entre esses dois conceitos O que significa desnaturação e

o que significa precipitação quando nós falamos em Deus na apuração de uma proteína nós estamos falando em perda da estrutura tridimensional É frequente perda da atividade biológica como vocês já viram nas aulas teóricas atividade biológica da maioria das proteínas é intrinsecamente independente da sua estrutura tridimensional quando uma proteína perde a sua estrutura terciária ela também perde a sua função biológica já quando nós falamos em precipitação nós estamos falando em insolubilização nós estamos inferindo que essa molécula deixou de ser solúvel no meio ou seja uma molécula que estava solúvel depois de precipitada fica insolúvel na solução

em grande parte dos casos a Deus naturação de uma proteína acarreta na precipitação dessa proteína mas a gente em casos especiais em que a desnaturação não leva à precipitação e também existem casos em que uma proteína pode ser precipitada ou seja in solubilizada sem que haja mudança na sua estrutura tridimensional ou seja sem que ela diz Nature E essas técnicas como nós veremos adiante o bastante importante para o trabalho de purificação eo isolamento de proteínas e nós vamos ver agora no nosso segundo experimento algumas condições que levam a desnaturação de proteína e logo em seguida

nós vamos ver como que cada uma dessas condições afeta a estrutura tridimensional das proteínas então segundo experimento ok pessoal então para esse nosso segundo experimento nós vamos usar quatro tubos que é que estão numerados de quatro até sete né o tubo um dois e três foi no primeiro experimento as reações de coloração então aqui a gente vai usar os tubos 4 5 6 e 7 4 tubos novos O que nós vamos fazer em todos esses tubos nós vamos colocar 1 ml de solução de proteína 10 porcento bom então vamo lá ó é muito bem pessoal

então em cada um dos tubos agora nós temos 1 ml de solução de proteína a 10 por cento nós vamos fazer quatro diferentes tratamentos em cada um desses tubos para ver o que que acontece com as proteínas que estão em solução então o primeiro tubo nós simplesmente vamos aquecer a 100 graus por três minutos tá então tudo quatro vai ser o nosso tubo de efeito do calor nas proteínas Então vamos colocar esse tubo aqui no banho-maria 100 graus durante três minutos então vamos colocar agora o tubo 4 por três minutos a 100 graus vamos lá

e vai ficar Três minutinhos aí é muito bem passado três minutos vamos tirar o tubo 4 ó ó já podem ver como é que ficou vamos voltar lá para bancada é muito bem gente passado os três minutos no banho maria você já tinham visto quando eu tirei do banho que aconteceu com esse tubo ele era uma solução translúcida e agora ele é uma solução opaca conseguem ver a significa que as proteínas que estavam nesse tubo agora estão desnaturadas e consequentemente precipitadas Então esse é o efeito da do calor nas proteínas que estão em solução no

tubo cinco o que que nós vamos fazer nós vamos adicionar a essa solução de proteínas 1 ml de ácido tricloroacético o assunto licor acético é um ácido forte da portanto a gente vai esperar que o PH seja drasticamente reduzido nesse tubo Então vamos lá então eu tô aqui com o ácido tricloroacético eu vou adicionar eles pertinho aqui para ver se vocês conseguem enxergar na câmera que que acontece e a morte o Olá imediatamente assim que eu adiciono o ácido tricloroacético Olha o que acontece o material fica esbranquiçado significa que as proteínas que estavam aqui desnaturar

ão e precipitaram ok e no tubo 6 nós vamos adicionar agora a essa solução de proteínas que já está aqui um ml de uma solução de acetato de chumbo a cinco porcento bom então novamente eu vou adicionar aqui para vocês verem que acontece eu falei lá imediatamente assim que eu adiciono não esse saúde metal pesado acetato de chumbo na concentração de cinco porcento as proteínas que estão ali desnaturam e precipitam E aí E aí e por último nesse experimento nós vamos adicionar ao todo sete um ml de etanol álcool etílico que é um solvente orgânico

E aí o Tom mais uma vez eu vou mostrar para vocês o que acontece conforme eu adiciono álcool etílico dá uma estradinha Eu percebo que a solução que era translúcida ficou opaca branca branquiçada Isso significa que o álcool etílico também desnatura as proteínas e consequentemente elas foram precipitadas por isso que fica branco assim o ok pessoal então aqui nós vemos quatro processos diferentes que causam a desnaturação das proteínas por calor por adição de ácidos por adição de metais pesados ou por adição de solventes orgânicos todos eles desnaturam as proteínas e consequentemente causam a precipitação dessas

moléculas é por isso que todas essas soluções que eram translúcidas quando a proteína estava solúvel Ficam esbranquiçadas ficam opacas quando a proteína é precipitada então agora vamos ver com um pouco mais de detalhe como cada um desses processos afeta a estrutura tridimensional das proteínas causando a desnaturação bom então como vocês viram no experimento tanto aumento de temperatura quanto a adição de ácidos fortes ou seja mudanças drásticas de PH quanto a adição de metais pesados e também de solventes orgânicos afetam drasticamente a estrutura tridimensional das proteínas fazendo com que elas desnatura em e consequentemente precipitem vamos

ver como que cada um desses fatores afeta molecularmente a estrutura dos proteínas como você já viram na aula teórica O que mantém a estrutura terciária de uma proteína são Principalmente as interações moleculares fracas as interações moleculares fracas são principalmente por ordem de força a seguinte as pontes de hidrogênio que são as mais fortes e mais frequentes as interações dipolo-dipolo que são interações entre cargas positivas e negativas as interações hidrofóbicas que ocorre principalmente nas cadeias laterais daqueles aminoácidos hidrofóbicos e as interações moleculares mais fracas que são as interações de Van Der waals que tem uma importância

menor na manutenção da estrutura terciária das proteínas o ator nessas moléculas então se nós observamos a estrutura tem Dimensional de uma proteína hipotética nós podemos imaginar que os aminoácidos que formam as proteínas estão sendo mantidos nas posições corretas através dessas interações moleculares fracas quando nós adicionamos calor ao sistema Ou seja quando você aquece a solução o que está acontecendo na prática é que todas as moléculas presente nessa solução vão entrar em um estado de excitação térmica maior Ou seja as moléculas vão começar a vibrar com mais energia Conforme você aumenta a temperatura a vibração das

moléculas também aumenta as pontes de hidrogênio que mantém as estruturas secundárias e terciárias as proteínas serão desestabilizadas serão rompidas caso a energia térmica exceda a força de manutenção da estrutura Ou seja a energia térmica rompe as interações moleculares fracas pelo aumento da vibração das moléculas no sistema uma vez rompidas as interações moleculares fracas a proteína perde a sua estrutura tridimensional ela diz Natura e consequentemente se você já viram nas nossas aulas sobre PH e tampão aqui grupos ionizáveis podem ser protonadas ou desprotonados de acordo com o PH do Meio vocês também sabem que as proteínas

são formadas por aminoácidos que podem conter grupos laterais com grupo de olhos azuis carregados positivamente no caso de grupos básicos ou negativamente no caso de grupos ácidos Considerando o PH fisiológico em torno de sete portanto as interações moleculares fracas do tipo dipolo-dipolo entre uma cadeia lateral ácida e uma cadeia lateral básica entre dois aminoácidos na estrutura da proteína pode auxiliar na manutenção da estrutura terciária desta proteína uma vez adicionado um ácido a solução Ou seja quando a concentração de prótons aumenta a tendência é que os grupos ionizáveis sejam protonadas portanto aquelas cadeias laterais dos aminoácidos

ácidos que estavam com uma carga negativa quando estiverem na presença de uma concentração maior de próprios por causa da adição de um ácido serão protonadas e portanto p a carga isso obviamente desestabilizar a as interações dipolo-dipolo uma vez que uma carga positiva que interagia com uma carga negativa agora não tem mais com o que interagir novamente você desde estabiliza a estrutura terciária da proteína e ela vai desnaturar o mesmo princípio pode ser entendido se ao invés de um ácido forte você adicionasse uma base forte a solução nesse caso por causa da diminuição da concentração de

prótons os grupos ionizáveis das cadeias laterais seriam desprotonados o que afetaria Principalmente as cadeias laterais com grupamentos básicos têm PH fisiológico estarão carregadas positivamente mas que seriam desprotonados e portanto perderiam a sua carga na eventual subida do PH da mesma forma as interações dipolo-dipolo seriam desfeitas E a proteína desnatura a adição de sais de metais pesados a uma solução de proteínas Especialmente quando essa solução de metais pesados está em alta concentração como é o caso do acetato de chumbo a cinco porcento que nós usamos Olá meus maturação das proteínas pela formação de proteínato de metais

pesados qualquer saúde metal pesado que a gente for utilizar seja chumbo Mercúrio cádmio ou estranho por exemplo quando em solução vão liberar os cátions de metais pesados que na sua grande maioria são íons divalentes ou seja tem duas cargas positivas essas cargas positivas tem uma alta afinidade pelas cargas negativas presentes nas proteínas e significa que em altas concentrações esses iam divalent de metais pesados vão se ligar as cargas negativas presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos que formam as proteínas além de afetar as interações dipolo-dipolo que estabilizaram a proteína a formação desses proteínato de metais pesados

devido à grande densidade de Sião também faz com que a proteína desnatura e precipite e no nosso último tubo do experimento anterior vocês viram o efeito de um solvente orgânico na desnaturação das proteínas quando uma proteína está no ambiente aquoso aqueles aminoácidos que tem cadeia lateral polar normalmente se a superfície da proteína uma vez que tem a capacidade de formar Pontes de hidrogênio com a água ajudando portanto a solubilizar as proteínas na solução Em contrapartida aqueles aminoácidos que tem cadeia lateral Apolar tendem a ficar escondidos no interior da proteína fugindo da água que está ao

redor da molécula lá no meio da proteína esses aminoácidos com cadeias lateral hidrofóbica estabiliza uma estrutura tridimensional da molécula através das interações moleculares hidrofóbicas quando nós adicionamos um solvente orgânico ao meio que a proteína se encontra a constante dielétrica do Meio diminui ou seja a polaridade do Meio diminui isso faz com que aqueles aminoácidos da superfície que interagiram muito bem com a água não consiga interagir como solvente orgânico uma vez que a polaridade é menor Em contrapartida aqueles aminoácidos hidrofóbicos que se escondiam no meio da proteína agora tem a chance de vir até a superfície

e interagir com somente uma vez que a polaridade do ambiente Moodle isso faz Literalmente com que as proteínas virem do Avesso e elas perdem a sua estrutura tridimensional porque os aminoácidos hidrofóbicos agora vão interagir com solvente que tem uma menor constante dielétrica ou seja está mais Apolar novamente a estrutura tridimensional da proteína é completamente desfeita e ela por consequência precipita a maioria desses fatores de desnaturação é Irreversível ou seja uma vez desnaturada a proteína dificilmente recuperar a sua estrutura tridimensional é o que acontece por exemplo quando você cozinha um ovo a clara do ovo O

que é praticamente proteína pura ovo Albumina quando aquecido vai fazer com que essas proteínas desnature consequentemente precipitem e uma vez desnaturadas essas proteínas não recuperaram mais a sua estrutura terciária ou por acaso Alguém já conseguiu de se cozinhar um ovo a mesma coisa acontece para proteínas que foram desnaturadas por grandes variações de PH ou por adições de metais pesados ou de solventes orgânicos dificilmente elas recuperaram a sua estrutura tridimensional existe alguns casos específicos Entretanto a onde é possível precipitar proteínas variando o PH eu vou adicionando solvente orgânicos sem que elas naturen mas são exceções de

modo geral esses quatro fatores que nós vimos desnaturam proteínas de forma Irreversível existe contudo uma técnica muito importante utilizado em praticamente todos os laboratórios que trabalham com proteínas que o processo de precipitação fracionada de proteínas sem que haja desnaturação das proteínas ou seja com essa técnica nós podemos precipitar algumas proteínas selecionadas sem que elas vezes Nature ou seja mantendo a função biológica dessas proteínas e podemos portanto ressolubilização para utilizadas posteriormente é isso que nós vamos ver no nosso terceiro e último experimento de hoje então acompanha com bastante atenção faça suas anotações vamos lá para esse

nosso terceiro experimento o que nós vamos utilizar é 15 ml de clara de ovo então eu já tô aqui com a clara de ovo em Natura eu já separei aqui mais ou menos 15 ml tá eu quero que vocês percebam que a clara de ovo está bastante translúcida o que Oi meninas aqui estão solúveis ok O que nós vamos fazer aqui agora é adicionar água destilada a essa clara de ovo então eu vou adicionando e agitando com cuidado até vocês verem o que que acontece Então vamos lá e vamos agitando devagarzinho e adicionando água E

aí E aí E aí o ok pessoal então agora que a gente adicionou água destilada a clara de ovo vocês podem ver que o aspecto dela já mudou tá então ela era aquela solução translúcido amarelada quando tava In Natura e agora ela está esbranquiçada está opaca Oque significa então que as proteínas que tinham nessa clara de ovo estão precipitadas porém nesse caso essas proteínas não estão desnaturadas e a gente consegue responsabilizar essas proteínas se nós adicionaremos sal nessa solução para voltar ao equilíbrio iônico original então para demonstrar isso o que que eu vou fazer eu

vou pegar 2 ml dessa solução Vou colocar aqui nesse tubo de ensaio e nós vamos adicionar o cloreto de sódio a solução até que as proteínas sejam responsabilizados num processo chamado salting Ok então acompanha aí 2 ml de a solução de clara de ovo com água e agora nós vamos adicionar algumas gotas de cloreto de sódio nesse tubo para ver o que acontece com a solubilização dessas proteínas que estão precipitadas e novamente eu vou tentar fazer aqui para vocês irem acompanhada tá notem que o material tá mais ou menos branquiçado né consegue ver eu vou

colocar algumas gotas de cloreto de sódio o e agitar e imediatamente o material já volta a ser translúcido Oque significa que as proteínas que estavam precipitadas agora estão solúveis novamente esse processo é chamado de sal Tim a nós estamos solubilizando as proteínas pela adição de sal bom agora que as proteínas voltaram a ser solúveis agora a gente vai fazer o processo de salting-out ou seja nós vamos insolubilizar essas proteínas adicionando-os ao só que agora nós vamos adicionar ao invés de cloreto de sódio nós vamos adicionar sulfato de amônio Então nós vamos adicionar 4 ml de

sulfato de amônio e vamos ver o que acontece E aí o Tom vou mostrar para vocês aqui de novo olá olá é um ml agita há 2 meses se agita a 3 ml o e quatro MS E aí se consegue observar Gente esse precipitados fica bem Evidente tá então esse é um processo chamado de salting-out as proteínas estavam solúveis né num ambiente único adequado nos adicionamos sulfato de amônio que um sal bastante volumoso esse sal promove a precipitação das proteínas entretanto essas proteínas não estão desnaturados elas podem ser responsabilizados nessa gente diminui a concentração de

Saúde Novo por exemplo adicionando água destilada nós conseguimos responsabilizar essa proteína de uma forma que ela esteja biologicamente ativa ou seja sem estar desnaturada' Oi ok bom então esse é o processo de sal Tim e salting-out vamos ver com um pouquinho mais de detalhe como é que eles funcionam e como vocês viram pela variação da adição de sal numa solução nós conseguimos solubilizar ou insolubilizar proteínas num processo chamado de sal Tim quando vocês o mobiliza proteína pela adição de sal e num processo chamado de salting-out quando você insolubilizar proteína pela adição de sais mas vamos

ver com um pouquinho mais detalhe como é que eles funciona afinal de contas nós usamos dois sites diferentes por salting-in nós usamos cloreto de sódio e pro salting-out nós usamos sulfato de amônia a escolha desse sai sai bastante importante e afetam diretamente o que nós queremos fazer com as proteínas então perceba quando nós tiramos a clara de ovo solúvel In Natura a gente tinha uma concentração de sal ideal para que a ovoalbumina ou para que as proteínas dentro dessa clara de ovo estivessem isso quando nós adicionamos água destilada o que nós estamos fazendo é diminuindo

a concentração de sais nessa solução aquele sal que antes estava numa concentração ideal é fundamental para auxiliar na mobilização das proteínas os sais presentes no meio interagem com as cargas positivas e negativas a proteína e ajudam a estabilizar a solubilidade quando a gente diminui a concentração desses sais pela adição da água destilada nós estamos promovendo a interação de cargas entre as proteínas ou seja nós estamos favorecendo a interação proteína-proteína isso vai fazer com que as proteínas se juntem em grandes aglomerados e príncipe tem tem alterar a estrutura tridimensional de cada uma delas bom se nós

estabelecemos a concentração de sal ideal que é o que nós fizemos quando a gente adicionou cloreto de sódio a solução nós estaremos favorecendo agora que aquelas cargas positivas e negativas das proteínas interajam novamente com solvente interajam novamente com esse sal que está no meio e diz favorecemos a interação proteína-proteína portanto a proteína volta a ser solúvel esse processo de solubilização pela Adição de sal é o que nós chamamos de sal team sob a pena ou colocar a proteína em solução pela adição de sal o que aconteceu na segunda etapa do experimento quando nós colocamos sulfato

de amônio na solução é que a água que estava solubilizando as proteínas agora foi roubada pelo sulfato de amônio para se solubilizar percebam a diferença de estrutura e esses dois sais O cloreto de sódio é um sal formado apenas por dois átomos de cloro e sódio que é o sulfato de amônio é um sal formado por dois irmãos bastante grandes O sulfato so41 em um bastante volumoso reunião anônimo também com cinco átomos ou seja O sulfato de amônio é um sal que precisa de muita água de solvatação precisa de muita água para que ele fique

solúvel no meio portanto na presença de sulfato de amónio a água que estava solubilizando as proteínas agora vai ser deslocada para solubilizar esse sal sulfato de amônio essa retirada da água de solvatação das proteínas favorecem novamente a inter a e ainda proteína ela se juntem aglomerados e precipitam num processo chamado salting out in solubilização das proteínas retiradas das proteínas da solução pela adição de sal é importante reforçar aqui novamente no salting-out a gente não tem a desnaturação das proteínas portanto se neste momento nós adicionarmos novamente a água destilada e retomarmos aquele equilibrio iónico retomarmos a

concentração de íons ideal as proteínas voltam a ser solúveis e funcionais é por isso que essa técnica é muito importante nos Laboratórios que trabalham com proteínas nós podemos precipitar proteínas diferentes com concentração de sulfato de amônio diferente dessa forma promovendo a purificação eo isolamento de proteínas para que possam ser usados em experimentos de laboratório bom então muito bem pessoal Essa foi a aula de hoje eu espero que vocês tenham entendido um abraço a todos e até a próxima E aí [Música] E aí