E aí meus queridos amigos e amigas Beleza pura com todos vocês na nossa sétima aula do curso de microbiologia ainda falando de microscopia vamos entrar na parte de microscopia de fluorescência e nessa aula específica eu vou mostrar para vocês os conceitos gerais do uso da microscopia de fluorescência vou explicar o que que significa fluorescência não adianta nada a gente estudar microscopia de fluorescência sem saber de fato Qual é o princípio de funcionamento da fluorescência Então a gente vai dar uma olhadinha bem rápida aí nesse processo e por fim eu vou terminar falando de como funciona
o microscópio de fluorescência e quais são as suas principais aplicações daí a gente já vai dar uma relativa olhada aí na parte de conceitos Gerais Beleza então vamos começar aqui mostrando o seguinte nas aulas anteriores a gente viu esses três tipos de microscopia óptica que é microscópio óptico comum de Campo escuro e de contraste de fase esses três tipos de técnicas de microscopia nos permite tem uma visualização muito boa da estrutura celular visualizar núcleo citoplasma o molde que a célula apresenta muitas vezes nós conseguimos identificar o que que é o citoplasma o que que é
o núcleo porém sempre que nós utilizarmos esta microscopia nós iremos ter uma visualização Total das estruturas Em algumas ocasiões utilizando técnicas de imunoquímica nós conseguimos identificar determinadas regiões ali da célula mas se nós quisermos identificar especificamente um ponto e omitir os demais nesta técnica nós não conseguimos esses três tipos de microscopia visualizam a célula como um todo pode-se ter um destaque de um determinado ponto da célula utilizando imun histoquímica porém nós sempre iremos visualizar a célula como um todo quando a gente quer visualizar um ponto específico e não quer visualizar o resto o resto significa
um interferente na microscopia de fluorescência nós conseguimos ter uma visualização ual das estruturas das células Por que que a gente consegue ter essa visualização pontual porque a microscopia de fluorescência utiliza anticorpos específicos acoplados a fluoróforos que são moléculas fluorescentes para a visualização de pontos específicos da células ou seja nós podemos utilizar esses anticorpos contra uma proteína específica qualquer e ver qual é a localização dela na célula Então esse anticorpo se liga essa proteína e esse fluoróforo vai emitir uma fluorescência quando excitado por uma luz específica E aí nós apenas iremos visualizar as regiões das células
que possuem esta proteína específica então a gente pode localizar ela ver se ela tá no núcleo ver se ela tá no citoplasma em alguma organela Então essa é uma ferramenta muito interessante para uso de diagnóstico de localização de produtos celulares não só de localização Mas também da presença ou ausência dele naquele tipo celular e pra gente entender obviamente a microscopia de fluorescência nós temos que entender o que é é fluorescência basicamente a fluorescência é o princípio pela qual uma substância é capaz de emitir luz em determinado comprimento de onda quando é excitada por outro comprimento
de onda então ocorre da seguinte forma nós temos um comprimento de onda ele excita essa substância e essa substância emite outra luz em outro comprimento de onda para ter uma melhor noção é diferentes cores pra gente entender isso vamos dar uma olhadinha nesse exemplo aqui então Vamos pegar esse elétron que tá numa camada aí de um átomo qualquer um átomo fluoróforo Tá ok E aí nós emitimos a luz azul neste átomo quando a luz azul atinge este átomo ela vai fornecer um pacote de energia para que esse elétron deste átomo específico salte para sua próxima
camada então ele absorve essa energia esse pacote de energia que é estudado pela física quântica ele absorve Esse pacote de energia e ele salta para a próxima camada dependendo da quantidade de energia ele pode soltar até mais de uma camada bom a energia é fornecida quando a energia é fornecida o elétron ele permanece aqui num estado excitado porém no decorrer do tempo ele vai perdendo essa energia e vai voltando para suas camadas até ele retornar para o seu estado basal que é a camada a onde ele pertence e aí ele emite energia quando retorna para
a sua camada de origem e essa energia emitida na forma de onda geralmente a onda emitida na forma de luz veja que nós usamos a luz azul para conferir energia a este elétron deste átomo ele absorve essa energia é excitado e vai perder essa energia quando ele perde essa energia e volta para o seu estado bazar seu estado fundamental ele emite uma luz verde essa luz verde é uma luz de menor energia em relação à luz azul a princípio a luz azul ela tem um comprimento de onda menor do que a luz verde quanto menor
o comprimento da onda de uma onda eletromagnética mais forte ela é então a luz azul é mais forte que a luz verde e toda vez que nós excit armos esse elétron desse átomo com a luz azul quando ele perder energia ele vai emitir a luz verde tá ok e isso obviamente a gente chama de fluoróforo somente substâncias que são fluoróforos são capazes de absorver a energia em determinado comprimento de de onda e emitir essa energia em outro compimento de onda existe toda uma propriedade dos átomos eles têm que ter um elétron numa camada específica e
nessa camada tem que ter um pacote de energia específico para excitar este elétron por exemplo se nós emitirmos aqui a luz verde esse elétron não vai ser excitado somente a luz azul e tem átomos que não são excitados por nenhum tipo de luz eles não são fluoróforos então tem todo uma estrutura todo um estudo específico para identificar se este átomo ou essa substância ela é ou não é um fluoróforo beleza e aí uma coisa que a gente tem que diferenciar também que fluorescência é diferente de fosforescência no caso da fluorescência quando nós conferimos energia a
partir da estimulação de uma luz de maior intensidade que no caso anterior foi a luz azul ele excita aquele elétron e ele rapidamente retorna ao estado fundamental o estado basal dele emitindo a luz verde sendo que se nós cessarmos A emissão da luz azul por exemplo o elétron ele não fica mais excitado ele não emite mais a luz verde então é absorção e emissão ao mesmo tempo é super rápido este evento já a fosforescência não o elétron do átomo que é um agente que emite luz em outro comprimento de onda ele recebe a energia emitida
por um certo comprimento de onda retém essa energia por algum tempo e ela vai perdendo essa energia aos poucos um exemplo clássico disso são aqueles controles de televisão que ficam iluminados quando você incide luz neles eles ficam verdes por um certo período de tempo depois eles perdem a coloração então a luz é emitida o elétron ele retém essa energia por um pouco mais de tempo e aí ele vai retornando lentamente ao seu estado fundamental de modo que a perda de energia emissão ela vai diminuindo gradativamente não se sabe muito bem o mecanismo porque isso acontece
e também não é intuíto dessa aula explicar o porquê só aqui mostrar essa diferença bom sabendo o que é a fluorescência vamos passar então pro mecanismo de funcionamento do microscópio de fluorescência basicamente os principais componentes do microscópio de fluorescência São um filtro de luz que vai permitir a excitação de um feixe de luz para um determinado comprimento de onda então a gente pode escolher os comprimentos de onda que a gente quer utilizar que é da cor azul cor verde cor vermelha cor amarela enfim são diferentes tamanhos de onda que possuem diferentes cores e a gente
tem que ter um filtro também de emissão que nós vamos atingir a amostra com a cor azul e aí vamos emitir uma outra cor essa outra cor ela tem que ser captada por esse outro filtro vamos ter lentes objetivos oculares obviamente para ampliar a resolução da nossa amostra ali e também nós temos um espelho de Cico esse espelho de Cico ele vai fazer o filtro da luz que vai passar até os nossos olhos Ok se passar por exemplo uma luz vermelha esse filtro ele vai filtrar se caso seja um filtro somente para a luz verde
Beleza então vamos dar uma olhadinha aqui nessa estrutura que permite a gente entender como funciona o microscópio de fluorescência então nós temos aqui uma fonte de luz que vai emitir todos os comprimentos de onda essa fonte ela vai passar por um filtro de estação esse filtro de estação é um filtro que vai selecionar o comprimento de onda específico que a gente quer Então nesse caso aqui é a cor azul a cor azul por sua vez ela vai refletir aqui no espelho de Cico ou seja ele vai passar aqui para a nossa amostra ele reflete diretamente
paraa Nossa amostra quando ela incide por ser uma amostra que tá condicionada a um fluoróforo ele vai absorver essa energia da luz azul e vai emitir na luz verde então ele emite Aqui passa pela objetiva novamente esse espelho ele não filtra a luz verde ele deixa ela passar e aí vai passando passa por um filtro de emissão para ampliar a leitura e vai passar pelo ocular e finalmente por um detector geralmente microscopia de fluorescência nós podemos utilizar ou direto a ocular nos nossos olhos ou num detector que transmite a imagem para um computador é muito
mais seguro utilizar a imagem que transmite para um computador porque muitas vezes comprimentos de onda próximo ao Violeta que geralmente são utilizados são nocivos aos nossos olhos então passa paração do detector E aí a gente consegue visualizar as amostras fluorescentes beleza e aí uma observação importante é que como se utiliza anticorpos acoplados a fluoróforos é possível localizar estruturas específicas das células como eu falei para vocês e aqui eu vou dar um exemplo de uma imagem de localização de estruturas específicas da célula Então veja aqui a gente tem um fundo escuro que é um fundo que
não está corado com o agente fluoróforo ele apenas está em certos pontos da célula e Aqui nós temos três agentes fluoróforos diferentes que foram colorados na mesma célula olha só que interessante que essa técnica nos permite chegar aqui nessa figura a nós temos esse R2 que é um fator de crescimento epidermal que geralmente é produzido em casos de câncer de mama né Ele é altamente Expresso E aí Nesta mesma célula foi foi utilizado um outro anticorpo contra outra macromolécula desta célula que é a Bet actina que é um marcador de citoplasma da célula Então veja
nós temos um anticorpo que marca esta proteína R2 um outro anticorpo que marca as proteínas que somente são de citoplasma e veja que elas são excitadas em diferentes comprimentos de onda por isso que elas emitem cores diferentes e aqui no C nós temos esse dap que nós chamamos de fenil indol esse di amidin fenil indol ele se liga a regiões do DNA ricas em adenosina e timina como adenosina etima do DNA estão apenas presentes no núcleo você vê que o dap ele apenas Cora o núcleo da célula então você não vê a delimitação do citoplasma
visto que esses três corantes fluoróforos que foram empregados para localizar diferentes estruturas das células foram feitas na mesma célula E aí por técnicas de computador nós podemos juntar essas três cores em uma única imagem que a gente chama de merge E aí você consegue determinar a localização específica dessa proteína por exemplo que é o nosso interesse a gente vê que ela tá muito presente aqui no citoplasma ela está presente muitas vezes ao redor aqui do núcleo Tá certo em determinadas ocasiões ela tá presente aqui bem próxima ao núcleo em alguns pontos aqui porque ela tá
sendo expressa e muitas vezes direcionada mas a gente consegue ter uma noção de localização e essa ação de localização muitas vezes nos permite chegar numa conclusão de diagnóstico de determinados tipos de cânceres determinados tipos de doença uma doença x Por exemplo essa proteína ela costumeiramente está no citoplasm quando o indivíduo desenvolve câncer por exemplo ela passa estar presente também no núcleo então isso serve muito para diagnóstico e uma coisa interessante também que a técnica de microscopia de fluorescência pode ser empregada para análises em células vivas ou mortas no caso das microscopias anteriores somente a contraste
de fase nos permitir analisar células vivas já na microscopia de fluorescência a gente pode analisar células vivas ou mortas e nem sempre a gente utilizza por exemplo um fluoróforo acoplado um anticorpo nós podemos utilizar uma proteína fluorescente que nós fazemos uma modificação biotecnológica naquela célula para que ela expresse essa proteína fluorescente acup plada da outra proteína E aí a gente consegue ver a modulação de produção dessa proteína de acordo com o tempo olhando no microscópio de fluorescência então isso nos confere uma capacidade muito grande muito vasta de diagnóstico de estudo em pesquisa beleza pessoal bom
é isso aí essa foi a referência que eu utilizei para essa aula clássica referência de microbiologia espero que vocês tenham gostado dessa aula foi uma aula relativamente longa mas se vocês gostaram por favor dá aquele joinha aí para ajudar da escola de ciências da vida se vocês me ajudam obviamente vocês também estão ajudando a divulgar a escola de ciências da vida e ajudando também outras pessoas serem beneficiados aqui pela escola de ciências da vida e se vocês quiserem participar se inscrevam aqui no nosso canal do YouTube que vocês ficam a par de todas as nossas
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