fala gente bonita desse meu Brasil tudo bem com todo mundo faz um tempão que não apareço por aqui né mas hoje resolvi dar as caras no canal para a gente fazer uma aula de ensaios microscópicos e nessa aula na verdade para não ficar uma aula muito extensa Eu dividi ela em três aulas diferentes a primeira aula a gente vai falar um pouco sobre monocistoquímica na segunda aula que espero já gravava na semana que vem a gente vai falar de microscopia de fluorescência e a terceira aula a gente fala um pouquinho de microscopia eletrônica hoje a
gente vai falar da imunesto química e quando a gente fala isso em aula gente essa aqui é uma aula na verdade é uma aula teórica para falar sobre uma prática Laboratorial Só que essa prática que a imunesto química no caso que a gente vai ver a gente não vai aprender a fazer a técnica só com essa aula teórica para a gente aprender a desenvolver a técnica de monstro química e assim com várias técnica que a gente que eu já falei aqui no canal inclusive que a última aula que eu tava dando uma olhada no canal
lá que fui publicada foi a de Western Bloch então a gente viu ali na teoria como funciona a técnica mas para a gente aprender mesmo tem que botar a mão na massa né gente então hoje essa aula para a gente ter essa ideia Geral de como funcionam essas técnicas na verdade a primeira aula é administroquímica e as outras também de microscopia de fluorescência é microscopia eletrônica a gente vai com essas aulas tem uma ideia Geral de como funciona essas microscopias sem da grande Sim a gente ter grandes aprofundamentos nessa aula mas vamos começar né mas
como eu sempre faço eu tiro a gravação do meu rosto eu coloco esse esse vídeo iniciar mostrando a minha carinha aqui para que vocês me conheçam Eu sou professor roni roni Brito e sou professor de imunologia e de vez em quando a gente trata um pouquinho de algumas técnicas também no caso da microscopia que a gente vai trabalhar aqui tanto na imunesto Química como na microscopia de fluorescência e até mesmo microscopia eletrônica o que eu vou abordar mais vai ser o uso dos anticorpos monoclonais que se ligam a essa células aos cortes aos tecidos e
a partir daí a gente consegue observar na microscopia em técnicas diferentes e microscópios na verdade o microscópio da microscopia Na verdade são microscópios diferentes mesmo que é a microscopia da hemonistoquímica a gente vê naquele microscópio convencional esses que vocês tiveram aula prática na faculdade de vocês já a microscopia de fluorescência eu preciso de um microscópio de fluorescência que aí eu tenho lasers específicos esse microscópio para ele poder excitar os foro cromos e que a partir dessa citação dos cromos eles emitem uma um comprimento de onda diferente uma luz que aí no microscópio eu tenho detectores
para isso e filtros e a microscopia a eletrônica também é muito diferente é um microscópio grandão ele eu acho que na universidade não são todas as Universidades que possuem mas é algo interessante de a gente ver também e quando a gente chegar nessa aula que a terceira aula eu vou mostrar umas figuras bem legais de microscopia eletrônica Tá bom agora vale no programa tirar a gravação no meu rosto porque gravando o rosto do Roni É Só atrapalha na verdade a visualização dos slides e o que importa é veja os slides aprenda alguma coisa dessas aulas
né então vamos lá ensaio os microscópicos aula 1 então aula de monocistoquímica sendo que nas próximas aulas a gente vai falar sobre a microscopia de fluorescência deixa só pegar uma caneta aqui para eu riscando microscopia de fluorescência e a microscopia e eletrônica e hoje a nossa primeira aula a gente começa a falar da imunesto química monitoquímica gente é algo muito interessante a gente vai usar um anticorpo contra alguma coisa naquele tecido e esse anticor ele vai estar conjugado com uma enzima que é a peroxidase e quando você coloca o substrato da perioxidase ela reage e
ela Vai depositando sobre o corte histológico é precipitando E vai deixando uma cor amarronzada castanhada como vocês estão vendo aqui ó essas partes mais castanhas e isso então é um é um corte clássico de monitoquímica e na imunesto química o que que para que para que que ela serve né exatamente ela vai nos mostrar alguns detalhes da célula então pensem assim ó se você tem uma um corte histológico aqui tá lâmina por exemplo aí o seu corte tá aqui e aí você quer ver saber se naquele corte vai ter a expressão de alguma coisa vai
ser importante para aquela marcação sei lá quero procurar CD3 para saber se você tem três tá aqui presente nesse corte que é uma molécula que a gente encontra presente nas células T por exemplo então o que que eu faço eu vou me utilizar de um anticorpo monocronal e esse corpo nuclenal ele é específico para se dizer três ele foi construído para se ligar Alfa de três e conjugado a esse corpo monoclonal eu tenho uma enzima perioxidase que ao contato com seu substrato ela reage e dá esse Tom a castanhado na lâmina quando a gente observa
na microscopia então por isso que tá aqui me quer importante porque ela determina a expressão de marcadores específicos e diferentes tipos celulares aqui foi só um exemplo o exemplo do CD3 e com a imunidade química ela possibilita o que também avaliar a expressão da proteína alvo da proteína que você tá procurando se tem muitos têm pouco vê a sua distribuição que locais que essa proteína está distribuída distribuída bem como a sua localização as aplicações mais comuns para imunistoquímica Então a gente tem lá a confirmação de diagnóstico de alguns de algumas doenças a classificação de tumores
por exemplo a gente sabe que a imunistoquímica ela é usada para você detectar proteínas naquela célula naquele tecido que normalmente são expressos em níveis muito baixos mas às vezes devido a transformação maligna que aquelas célula sofreu ela passa a expressar outros marcadores outros não esse marcador que tava sendo Expresso normalmente Em um nível basal aí ela começa a expressar fazer uma super expressão e isso pode indicar por exemplo é pensa de um tumor mais agressivo por exemplo em câncer de mama que é mais agressivo existe um receptor que é um receptor de crescimento epidérmico humano
que é chamado de Hair 2 que normalmente isso aí tá envolvido com crescimento de diferenciação e sobrevivência de células normais nos tecidos normais só que quando eu tenho essa transformação e a célula virou um câncer eu posso ter a super expressão desse Hair 2 e isso é um indicativo de câncer de mama mais agressivo por exemplo então se você faz tem um corte histológico de câncer de mama e tem super Expresso nesse corte histológico visto por imunistoquímica de Hair 2 por exemplo o patologista que vai analisar aquilo ali já vai saber que esse câncer ele
é um câncer mais agressivo do que os outros bom então Além disso eu consigo fazer também subspagem de linfomas de leucemias de mutações específicas prognósticos de algumas doenças Além disso na pesquisa o que que a gente faz eu já falei mas eu coloquei essa figura aqui a localização de proteínas eu consigo também ver a parte de divisão celular arquitetura e morfologia celular bem como tudo o lance de sinalização celular que é aquela parte que por exemplo aqui tem uma célula com receptor quando esse receptor ele é engajado e vou ter um tipo de sinalização intracelular
e eu consigo ver essas sinalização também por imunistoquímica bom para fazer a técnica eu preciso então de um passo a passo né então esse preparo do corte histológico ele se dá como lógico gente como eu falei lá no comecinho tá hoje a gente não vai aprender a fazer imunestoquímica na prática no laboratório isso aqui a gente tá vendo esse apanhado geral para a gente ter uma ideia de como a técnica se Desenrola aprender mesmo é quando vocês forem para o laboratório e a mão na massa que eu não sei nem se vocês vão é trabalhar
com imunestor química mas pelo menos com essa aula teórica a gente tem uma ideia de como técnica funciona então já é alguma coisa legal então na imunesto Química eu vou usar ela em cortes histológicos em material em blocada Então são aqueles cortes que foram preparados para receber aquela coloração de Hi por exemplo lembram que na na faculdade de vocês dos primeiros semestres tem aqueles aquelas aulas de histologia de biologia celular Muito provavelmente você já viram um corte histológico aquele que é meio Rosinha arroxeado corado com h e que é hematoxilina então quando a gente faz
a imunesto química o procedimento é muito parecido então o tecido ele foi embolocado em parafina e a partir daí a gente faz o corte esse corte então ele é levado para uma estufa e nessa estufa vai ser justamente para fazer a desparafinização desse tecido tirar a parafina faz então a parte de fixação com xilol e álcool na sequência a gente lava as lâminas em Água corrente só que aí nesse processo de fixação Pode ser que os eptos eles meio que fiquem escondidos então eu faço um processo que é o processo de recuperação antigénica então Por
conta desses fixadores eles podem ter um mascarar os repitos como eu falei antes e existem dois métodos básicos para a gente fazer essa recuperação de higiênica uma Eu uso o calor que aqui tem uma sigla em inglês ó que é o hits Até que foi mais ou menos a pronúncia e o outro método de Recuperação antigênica é o método enzimático que você usa algumas enzimas para você fazer essa recuperação desse antígeno a partir daí a gente tem que fazer o quê o bloqueio da peroxidase endógena por que que eu tenho que fazer esse bloqueio pensem
comigo gente eu não falei para vocês em algum momento lá para trás que na imunestoquímica eu vou usar o anticorpo monocronal contra alguma coisa e ele vai estar conjugado com enzima que no caso é a peroxidase pois bem Quando eu fizer a colocar o substrato da enzima para verificar se tem ou não aquilo que estou procurando no tecido por conta da reação da perioxidase que está conjugada ao anticorpo se eu não bloquear peroxidasendógena a perioxidase que eu encontro nas células normalmente Pode ser que eu esteja vendo ali algo que não é fidedigno eu posso estar
olhando para perioxidade endógena e achando que a peroxidase do que que tá conjugado ao anticorpo Então antes de continuar o meu processo do meu protocolo aqui de munistoquímica eu tenho que fazer o que um bloqueio da peroxidasendógena a partir daí então a gente pode e na sequência e saber que quando eu chegar ao final e observar aquela lâmina o que eu tiver vendo vai ser por conta que a peroxidase agiu no seu substrato precipitou algo é a castanhado na minha lâmina e eu tenho certeza que aquilo tá presente naquele tecido e não é um artefato
da técnica porque eu acabei sim bloqueando A proxidase então por isso é importante a gente bloquear a perioxidase bom gente dando continuidade então a imunesto química assim como algumas técnicas como por exemplo técnicas de aglutinação eu posso dividir ela em duas que eu chamo então de imunesto química direta e monitoquímica indireta indireta mas não quis exatamente significa isso esses dois tipos de Bonito bom a imunistoquímica quando a gente fala dá direta é quando eu uso um anticorpo monoclonal contra aquilo que eu estou procurando no tecido Porém esse tipo monoclonal ele é diretamente específico contra o
epítopo que eu tô procurando e esse anticorpo ele já está conjugado com peroxidase Eu não vou usar por exemplo anticorpo secundário então aqui na imunistoquímica direta Então eu tenho aqui um corte de um tecido a presença aqui dos repitos né de interesse que eu estou procurando o anticorpo E aí quando eu coloco esse corpo já conjugado com a peroxidase ele vai e liga ali a partir disso eu vou fazer então acrescentar o substrato da enzima que é o dab esse dado então ele vai reagir com a peroxidase e o dab reagindo com a peroxidase ele
precipita-se nesse local nesse local formando que uma coloração a castanhada nesse tecido é lógico a observação tanto da química direta quanto da imunista química indireta quando você olha o microscópio você vê lá os pontos a castanhados você não sabe se ela foi direto ou indireta Então o que a gente tá vendo aqui ele tá falando para vocês que quando chegarmos na bancada para fazer a imunidade existem essas duas possibilidades eu já tenho anticorpo anti aquilo que eu procuro já conjugado com a perioxidase ou eu tenho anticorpo purificado e esse corpo purificado ele não está conjugado
com nada e por isso que essa técnica quando usam de corpo purificado conjugado com nada e só depois usam anticorpo conjugado com a peroxidase eu chamo essa imunistoquímica de imunesto química indireta então direto o anticorpo primário como a gente está vendo aqui ele não está conjugado com nada ele não tem enzima nenhuma que grudado nele associado a esse de corpo Então como é que eu faço para ver se o depois né pro se vocês tiverem pensando depois o que que eu faço eu uso um anticorpo que é chamado anticorpo secundário e esse anticorpo aqui esse
secundário que tá aqui com a perioxidase ele é um anticorpo anti aquilo que eu estou procurando não né gente o anticorpo monocronal antes aquilo que eu estou procurando esse de baixo purificado que ligou aqui no tecido no tecido que foi brocado e colocado fez o corte histológico e colocou ali na lâmina e Já teve toda aquela preparação que a gente viu antes para que a reação de monitor química aconteça então o anticor primário é que é o específico para os epítopos que eu procuro no tecido aí para eu fazer a revelação desse desse corte como
esse corpo aqui ele é purificado primário ele é purificado e não tá conjugado a nada eu uso anticorpo secundário Aí sim este anticorpo secundário ele está conjugado com peroxidase e esse anticorpo ele é contra quem é um anticorpo Então esse anticorpo aqui ó ele é anti esse de baixo então ele vai mudar nosso corpo de baixo ele não é um anticorpo antioxido ele é antes de corpo com isso na sequência que que eu faço coloco substrato da peroxidase que no caso é o dab o dado então reagindo o que que vai acontecer aquilo que a
gente já conhece né eu vou ter a precipitação e formando Aquela aquele tecido acastanhado quando eu obser vo na microscopia bora ver aqui alguns exemplos então aqui gente é um corte histológico de uma biópsia de indeterminado com marcação para se adequado pensem assim ó você D4 assim como CD3 por exemplo que lá atrás ele tá presente em células T mas especificamente na célula ter auxiliar né que a gente tem sede4 é tcd8 e aqui como vocês estão vendo é um paciente que é negativo para HIV Ou seja é um indivíduo que nem é paciente não
divido normal ele não tem HIV e o indivíduo de cá é o indivíduo que é positivo para HIV o maiszinho positivo para HIV aí pro beleza entendemos Então você tá usando o que um corte histológico de indeterminado de um indivíduo que não tem nada né pelo menos HIV ele não tem e o outro caso o indivíduo que tenha HIV só que como a gente sabe quer dizer não sei se vocês sabem disso mas na infecção por HIV o HIV aquele vírus que leva a AIDS né Sem infecção o vírus Ele vai destruindo algumas células imunológicas
e as principais células imunológicas destruídas na infecção por HIV são as células tcd4 as células ter auxiliares pensando nisso o que que foi feito aqui nesse nesse corte histológico né a gente sabe que os pacientes para HIV então eles têm uma deficiência em células tcd4 porque o vírus vai destruindo as células 64 quando a gente usa a técnica de mono-istoquímica para ver a quantidade de células tc de 4 no intestino da pessoa no índio terminal do indivíduo que é soropositivo para HIV e a gente tá marcando para para a gente usou um anticor antes adequado
e pode ser tanto emisto-química direta quanto a indireta né gente mas o que a gente observa aqui ó vocês estão vendo que o lado de cá escrito riscando agora passando aqui a caneta vermelha eu tenho menos pontos em castanho ó quando a gente olha aqui o tecido tem menos pontos em castanho quando eu comparo aqui ó com o indivíduo que não tem HIV ele tem muito mais pontos a castanhados o que é que isso indica para mim isso indica que nesse indivíduo que é negativo para o HIV que ele não tem HIV com ele existe
mais marcação para se ter quatro nesse corte aqui indicando que hora se tem mais de quatro indica que tem mais células T concordam já do outro lado que o assanhado é bem menor se eu tenho menos a castanhado aqui indica que eu tenho que menos células 64 porque marcou menos Então essa marcação ele fala ele mostra o que para gente ele mostra justamente se essa se esse Justamente a imunossupressão a imunodepleção que o HIV faz nesses indivíduos que são contaminados com esse vírus Belê Bora para um outro exemplo aqui eu tenho um corte de Colón
também para mostrar célula cancerosa só que aqui eu não tô vendo CD4 vendo uma outra coisa eu tô vendo uma proteína p53 que vem do Gene p53 a p53 gente se vocês não sabem a proteína que ela é considerada aguardeando o Genoma porque porque ela faz uma manutenção da integridade do genome controla por exemplo a parada do ciclo celular o reparo do DNA se não dá para reparar ela manda essa célula para um processo já apoptose acontece que em algumas células quando ela se transformam e viram células cancerosas a expressão de p53 pode aumentar porque
porque o stress que foi causado ali pelo dano do DNA aumenta a fosforilação de p53 isso leva um aumento do que de p53 permitindo que ele que essa proteína então atua como fator transcricional E aí por isso que às vezes a gente acha ela e apesar dela ser uma guardiã do Genoma ela pode estar sendo super expressa para tentar arrumar o DNA que não tá sendo arrumado então ela vai sendo cada vez mais transforeda aumentando mais a quantidade dessa proteína e acaba sendo indicativo de que essa célula é uma célula transformada Além disso também posso
ter o p53 multado né gente se o gene tá multado eu vou ter uma proteína mutada logo a p53 não consegue exercer o seu papel que é esse papel de fazer a manutenção da integridade do Genoma então aqui eu tenho que um anticorpoint p53 e eu vejo aqui que no corte histológico de câncer colorretal igreja Então essas partes acastanhadas mostrando Justamente a p53 que está sendo super expressa aí nesse tecido e fazendo esse indicativo de de célula cancerosa o outro vai ser é um câncer de ovário né o próximo slide que esse aqui então eu
tenho aqui um ovário normal que foi feita a mesma técnica mas não parece nada de Castanha Ou seja eu joguei um anticorpoint p53 aqui joguei Mas como ele não tá super Expresso nem apareceu nada aqui ó tá vendo ó que que a gente enxerga o corte Limpo quando a gente compara com o lado de cá por exemplo que tá cheio de coisas castanhas porque foi depois que você fez tudo o passo a passo da imunesto química você consegue isso aí último exemplo gente aqui eu tenho quatro tumores de mama que foram curados para imunista química
para pesquisa de Hair 2 lembra lá do Hair 2 receptor de fator de crescimento epidérmico humano dois o rei dois ele regula o crescimento diferenciação sobrevivência em células normais e a super expressão de re2 pode indicar um subtipo mais agressivo de câncer então quando a gente olha aqui ó esses cortes ó no ar o score zero que é esse aqui ó não há coloração de membrana aí vamos para o b ó o b é esse aqui ó do ladinho score mais dois coloração circunferencial da membrana e mais de 10% das células porém fina tá vendo
aqui ó da castanhados ó C que é isso de carro lado de cá score mais um coloração fraca e parcial da membrana de mais 10% das células D que é esse último que é o mais castanho que a gente observar esse monte de rabisco o d é o score +3 coloração circunfal da membrana grossa e retrátil em mais 10% das células e os casos A e C são considerados negativos ó esse aqui o ato não tem nada de castanho e esse ser que tem um Squad mais um e a coloração é fraca especial então eles
consideram que isso acaba sendo negativo não tem um indicativo assim que é realmente um câncer ou um câncer agressivo certo gente então por aqui a gente vai encerrando a nossa aula de microscopia mas essa parte de imunesto química e na semana que vem a gente publica a próxima aula de microscopia que é aula de microscopia de fluorescência espero que vocês tenham entendido alguma coisa e que tenha sido útil e lembrando para aprender a técnica de imunesto química vocês vão aprender apenas colocar na mão na massa fazendo no laboratório isso aqui é para a gente ter
uma ideia Geral de como funciona a técnica não ficar tão cru se vocês ouvirem falar imunesto química que que é isso né pelo menos essa aula a gente tem essa ideia do que seja a imunistoquímica um abraço e até a próxima semana
