Micina, tá? Após isso, a gente vai tirar uma dessas colônias, tá? Vai fazer um pré-inóculo, que é basicamente colocar no meio de de cultura, crescer por um dia, mas depois a gente vai fazer o inóculo de fato, tá?
O inóculo dessas células transformadas, que aí a gente vai colocar num grande arlemia. Geralmente depende depende muito da proteína que você vai fazer. Às vezes você vai usar uma quantidade maior de de meio e às vezes você vai usar uma quantidade menor de meio, tá?
Então, essas colônias com as bactérias transformadas, elas são inoculadas em meio de cultura para adquirirem uma densidade populacional que torne uma indução de expressão da proteína eficiente. Então, entenda, por mais que essas bactérias já tenham o plasmídio incorporado nas suas nas suas células, elas não estão expressando a proteína recombinante, porque pela sua própria maquinaria genética, elas não vão expressar a nossa proteína, tá? Então, primeiro a gente vai fazer um inóculo para fazer com que essas células cresçam o suficiente.
A gente vai colocar isso num shaker, que é uma incubadora que vai, além de deixar ela quente, essa esse meio de cultura quente, vai agitar. tem um agitador. Então, a gente vai deixar lá e vai eh e vai monitorar vai monitorar a turbidez dess desse meio de cultura, que a gente pode perceber uma diferença de turbidez.
Isso aqui eu coloquei como exemplo, é um meio de cultura que foi feito tanto tão igual a esse meio de cultura da esquerda, mas o meio de cultura da direita não tem nenhuma colônia de de bactéria crescendo nele. Então é simplesmente meio de cultura. A diferença da turbidez entre eles é gritante, né?
Então, a gente vai monitorar através da leitura de absorbância e num comprimento de onda de 600 nanômid que vai indicar a densidade óptica, tá, desse meio aqui e vai mostrar quanto mais bactérias tiver, maior é a nossa quantidade. Quanto mais bactérias tiver, vai ser maior a leitura da absorbância. a gente faz uma densidade óptica entre 0 5 e 1, porque a gente não quer muita bactéria e a gente não quer pouca bactéria também.
muita bactéria também não seria bom para paraa expressão das proteínas e pouca bactéria também não seria eficiente. Então, nesse momento, a gente vai, a gente vai induzir a expressão da proteína recombinante, de fato, quando já temos um inóculo com uma densidade óptica desejada, tá? Tá?
Os genes controlados pelo promotor LC, eles ou que tem o operão LAC e serão controlados por esse promotor, eles podem ter a expressão induzidas pela molécula IPTG, que é uma molécula que a gente usa muito no laboratório. É, mas nem todas as induções vão ser feitas com IPTG, depende da construção do plasmídio, depende muito do caso, tá? Essa molécula é análoga à lactose e aí que entra o sistema de repressão e de indução eh dos nossos do operonc, tá?
Então vem vou vou mostrar aqui usando essa imagem, tentar explicar mais ou menos como isso acontece, tá? O genilá aqui aqui da da própria Ecolle, ele ele vai, quando ele é expresso, ele vai ele vai gerar essa proteína que é um repressor do laque, um repressor. lá que operou.
E que acontece? a ECO RNA polimerase, que expressaria T a T7 RNA polimerase, que é a polimerase que de fato vai fazer com que a sequência do nosso PET 28A, que é o nosso plasmídio, seja expressa, a gente não consegue expressar a RNA polimerase que vai expressar a nossa proteína. Então, não há uma RNA polimerase que expresse o que está dentro do nosso plasmídio, nosso vetor nesse momento.
Por isso não há uma expressão dessa proteína. A partir do momento em que a gente vai colocar o IPTG nesse meio, a gente vai ligar esse IPTG a esse lac repressor, tá? Aqui lack repressor e o IPTG.
O PTG tem uma afinidade por ele, tanto quanto a lactose também tem uma afinidade por esse repressor. E aí quando ele se liga esse repressor, há uma perda de afinidade do repressor pela eh pela sequência aqui do do operão lac, tá? E aí a RNA polimerase consegue expressar a sequência que vai dar origem a a T7 RNA polimerase, que então essa proteína aqui que é uma enzima, a RNA polimerase vai conseguir e se ligar ao promotor T7, que é o promotor da nossa sequência da proteína recombinando.
E quando se liga ao nosso promotor T7, vai de fato eh gerar a expressão da proteína recombinante. E a partir daí a gente vai ter a nossa proteína recombinante. A partir disso, a gente vai deixar também crescendo num shaker por um determinado tempo.
Depende do protocolo, depende do caso, depende da da proteína. Muitas coisas dependem de muitas coisas quando o protocolo de expressão é feito, tá? Eh, mas de fato, após isso, há uma coleta da amostra.
O que se coleta não é o meio, e sim apenas as bactérias que cresceram naquele meio e expressaram a proteína que a gente tem interesse em extrair daquela bactéria. A gente não quer a bactéria, a gente só quer a proteína que está lá dentro, tá? Então, fazendo indução, né?
A gente vai pegar esses meios, colocar nesses potes de centrífuga que eu mostrei aqui, tá? Só um exemplo. E a gente vai centrifugar.
A força centrífuga vai fazer com que as células das bactérias elas vão pro fundo desse desse nosso desse nosso potezinho de centrífuga, tá? E aí a gente pode jogar o meio de cultura fora. Lembrando que tudo, todo tipo de meio de cultura e outras amostras que contenham eh organismos que estavam vivos, elas devem ser inativas com álcool ou hipoclorito, tá?
não devem ser descartadas no mesmo lugar que as outras, que as outras amostras que não têm amostras com organismos vivos, tá? E isso para promover maior biossegurança, tá? Então isso aqui é de onde a gente vai tirar nossas proteínas, é o que a gente precisava, tá?
A partir disso, nesse nesse naquele próprio pote ali, a gente vai usar um tampão de lise que vai tá ali num pH, que seja o melhor, tanto para fazer a lise daquela daquela bactéria, quanto para manter a a proteína que foi que foi expressa estável, tá? E aí com aquele tampão de lis a gente vai tirar aquela aquele fundo de bactérias que tem lá e a gente vai fazer uma lise, tá? A lise basicamente a quebra da da membrana da da nossa bactéria para tirar o conteúdo interno, tá?
Eh, essa lise ela pode ser feita de diversas formas, tá? Você pode usar fazer a lise usando agitação com pequenos pedaços de vidro. dentro da da das alíquotas.
Então, esses pedaços de vidro, fazendo agitação, eles vão quebrar mecanicamente a a membrana da bactéria ou do outro organismo que se se está utilizando, tá? A gente pode usar a sonicação, que é uso de de pulsos de ultrassom. A gente pode também usar lise química.
Existem diversos tipos de ley e depende muito da eficiência e do que se se quer fazer com aquilo ou amostra, qual é a sensibilidade da amostra, qual a necessidade daquela amostra, tá? Então a líia química pode ser feita com detergente, com enzimas que quebrem a membrana ou por choque osmótico, tá? Aqui essa foto que eu tô mostrando para vocês é quando eu já fiz a liz da amostra, tá?
Esse sobrenadante, então essa parte líquida é onde a gente tem todo o conteúdo interno daquela bactéria. E essa parte aqui fibrosa ao fundo desses desses minitubos, desses microtubos ependorf são basicamente as par as membranas celulares, os restos celulares das bactérias. a gente chama essa parte desse sobrenadante aqui de lisado clarificado, tá?
A partir desse lisado que a gente produziu e a gente vai separar por centrifugação, então a gente vai tirar esses restos e vai utilizar sol sobrenadante. A partir disso, a gente vai poder fazer a nossa purificação das proteínas e são as recombinantes. Notem que o nosso oliado ele vai ter tudo que estava dentro da da bactéria e que foi que foi conseguiu se solubilizar no nosso tampão de lise, tá?
Então, tudo que era hidrossolúvel e que também talvez não era necessariamente hidrossolúvel 100%, mas que conseguiu se solubilizar ali, conseguiu sair nesse lisado. Então, não necessariamente só tem a nossa, na verdade não vai ter só a nossa proteína. Então, a gente podia, a gente deve fazer uma purificação.
Para fazer essa purificação, a gente usa diversos métodos, geralmente envolvos a cromatografia, tá? A cromatografia é um conjunto de técnicas de separação e análise de componentes de uma mistura. Nesse caso, a mistura é o lisado clarificado, tá?
Obtido através dessa lise que a gente tinha feito dessas bactérias que eu mostrei para vocês, mas também poderia ser a lise de outros microorganismos, tá? Eh, a gente vai ter uma fase estacionária onde as moléculas vão se ligar e uma fase móvel que é o transporte dessa mistura. dessas moléculas.
A eluição é a etapa de se extrair as alíquotas contendo as moléculas ligadas a fase estacionária. Então, muitas vezes a as moléculas que estavam ligadas à fase estacionária são aquelas moléculas que a gente tinha interesse. Então, por exemplo, a nossa proteína.
Nesse caso que a gente vai estudar aqui, a proteína primeiro vai se ligar à fase estacionária e depois de um tempo, quando a gente usar um tampão de eluição, que vai provocar uma eluição, ou seja, aquela proteína vai se desligar da fase estacionária e vai pr pra fase móvel e através dessa fase móvel a gente vai conseguir retirar essa nossa proteína, tá?
