Métodos de Separação e análise de proteínas: Western Blot

e começa a gló tinha uma técnica Laboratorial de biologia molecular que identifica proteínas específicas de uma determinada amostra a partir da separação e essas proteínas de um George poliacrilamida e ela composto então de acrilamida e da bisacrilamida essa combinação vai formar uma rede belmond é ou não pode isso que a gente conversa tem nas passem por ela a partir do processo de eletroforese que teria uma corrente elétrica queria bocado para o Ano ou seja negativo para o positivo para que essa separação aconteça Então as proteínas devem se encontrar na sua estrutura primária então de pé

a estratégia Para que ocorra de maturação essas proteínas um exemplo disso é a presença de sdf que é um detergente no tampão e por isso parte dessa técnica não seja quando estamos correndo de também conhecido como SSP SDS do detergente que vai no tampão para provocado na o primário eo page que seria de Polly tira olha aqui pela amiga então pelo fato das proteínas serem compostas por cadeias polipeptídicos de diferença aminoácidos ligados entre si elas possuem diferença estruturas que isso também confere a elas diferentes pesos moleculares por isso essa técnica é capaz de identificar diferentes

tipos de proteínas de acordo com seu peso molecular porque nesse Giorgio Colli clima poliacrilamida Elas serão separadas pelo seu peso para nós fazemos Matriz note então nós vamos precisar de um gel 1 bom então vocês podem perceber o que não devem chegar logo que o que ele é um gel como se fosse de cabelo mesmo E aqui nessa parte de cima nós temos esse peitinho quando eu tirar esse pontinho aqui onde tem o plástico perguntar o Buraquinhos Esse é o local onde eu vou aplicar as meninas amostra e Como disse anteriormente essa mostra Então essas

proteínas elas se separam a partir de uma corrente elétrica que vai passar por região Então como que eu vou posicionar esse gel que ele passa uma corrente elétrica mesmo aí gente precisa uma parada então nosso aparato de Então tá vendo ele tem uma parte aqui é o preto EA preta e essa parte aqui vermelho tá ele aqui eu vou conectar a uma fonte de energia o que que acontece a corrente elétrica ela vai passar da parte negativa da parte positiva isso que vai fazer com que a proteína mesmo se separem Portuguesa e onde eu vou

posicionar este aparato para que as proteínas para que passa essa energia não pode ficar sim simplesmente não precisamos colocar o líquido e mais pro nosso tampa e olha eu vou colocar isso e fica parado vai onde e amigos não bom Então essa é a nossa Cuba do Éster Button nós vamos simplesmente encaixar o nosso gel aqui colocar aqui dentro colocar no tampão de corrida e aplicarmos as amostras naquele potinho que eu falei para você eu vou mandar aqui ó bom então coloco aqui é o aparato Fashion tenho que ir agir e também não massinha preta

aqui então a parte preta também vai ficar onde está massinha preta que depois vai corretivo tive sempre vai passar desse lado para esse Quando eu colocar o tempo lembra que o disco tem colocar um tampão Então eu só de corrida de conhecer coloca aqui ó E aí E aí e pronto meu coração está pronto para que o aplica nas amostras aqui eu só preciso tirar aqueles pintinhos e eu tava o gel para faça os buraquinhos para eu colocar as mãos E aí é aquela seja aqui só tem proteja e eu coloquei um corrente esse corante

azul e ele serve para que nós simplesmente conseguiu para nós conseguimos enxergar as amostras como quando nós colocarmos ela não senão a gente não vai garantir se viver tô rodelas escolhi todo o link do não uma vez o extrato de proteína ele é transparente e nós fizemos aqui em cima aqui no protocolo do meu laboratório nós aquecermos essas amostras a 90 bom então aqui separado ele já tá aqui tem 95 graus eu vou colocar as minhas amostras aqui ó e vou esperar cinco minutos até ela aquecer a o último eu coloco uma substância chamada entendeu

um rapaz E aí E aí e terciária E aí E aí o valor o Face da sua família Bom dia eu não sei se vocês conseguem enxergar ter que nos pequenos Marquinhos aqui ó Focinhos como eu colocar a moto a gente vai conseguir enxergar melhor a hora para ver se eu vendo os buraquinhos Então agora que as minhas dá uma sugestão aquecidas eu vou aplicar lá aqui no Gel 1 bom então eu vou visitar uma quantidade fixa para todas as amostras aqui no caso de 14 micro litros Oi e eu sempre vou trocar a ponteira

Quando eu for para o petar é outra mostra para que eu não conta minha aquela mostra certo senão extrato de um de uma mostra está na outra já dá para vocês verem as amostras aqui nos próximos né agora que eu já apliquei aqui betei todas as minhas amostras no gel que eu preciso fazer como que eu vou saber qual o peso é copo com as proteínas aqui como que eu vou adivinhar então nós precisamos de um autômato chamamos de marcador marcador você que esse líquido eu vou aproveitar não consigo aqui do meu geral e ele

vai correr junto com as proteínas Só que já são pré-determinados eu vou explicar para vocês uma qualquer mais pra frente Como funciona o marcador e ele vai se preparar em coisas e e não ficar aqui começa agora eu peço uma quantidade menor que ele ele tem eficiente e E aí Hoje eu tô aqui então e o marcador do lado das minhas amigas bom e coloca uma j-coin como que eu coloco meu gel para correndo mostrar para você então coloco a minha Cuba o que coloca a tampa na minha culpa então eu tenho que garantir que

eu coloquei o preto no preto e vermelho no vermelho essa Cuba não permite que eu coloquei errado tá porque senão não encaixa é por causa desse Pinho aqui então encaixei vem aqui se prepara eu vou deixar correr ainda 40 Volts no começo e eu ir aos poucos eu vou aumentando Ah tá então já está correndo aqui vamos sair aqui é bem não é tão nítida Porque você tá com vontade muito baixa mas você ainda umas bolinhas que a corrente de ar passando um bom então sobre o marcador existem diferentes marcas modelos é basicamente marcador então

proteína já comprei esse conhecidos então cada uma das elas vão ter uma cor e e e elas vão se separar e aquela coisa representar determinado peso então quando você como marcador é ele já vem com a legenda dele né que é diz a tal cor é 80 km de altura a outra cor embaixo essa receita que Ronald disse assim por diante e uma coisa que é importante e interessante ressaltar é que proteínas elas se separam no gel de forma inversamente o quanto mais pesada mais próxima zocal quanto mais leve mais para baixo no carro ou

seja as pesadas não descem como a gente imagina que acontece nas soluções com solutos curto ou né elas ficam as pesadas ficam em cima elas se prendem em cima naquela rede de poliacrilamida enquanto as mais leves elas conseguem passar pelos poros eu não fico mais na parte de impacto gel então quando nós podemos uma membrana que com as proteínas dela Presidente as proteínas que estão mais acima da membrana que não proteinas mais pesadas que as proteínas que estão mais abaixo tá lembrando essas proteínas mais leves então passado algumas horas ou meu Jão correu aqui e

se vocês estarem bastante atenção é possível ver algumas marquinhas uma azul e uma vermelha e isso aqui é o marcador se separou tá então ainda era para ter mais correram e elas estão em diversas alturas diferentes por exemplo essa marquinha ver Oi aqui é a marca desse marcador dessa marca que eu utilizo ela é autora de 80 kilodaltons em todas as proteínas que tem 80 que eu dar os muito mais ou menos nessa linha só que eu não posso usar o gel dessa forma então vou fazer o processo de transferência e o que fazer G1

o separados pelo seu peso molecular Store e ela e para transferência nós fazemos um sanduíche nesse aparato preto e vermelho com uma esponjinha e um papel filtro em seguida Nós pegamos o gel Oh e vamos retirar o vidro de cima desse gel e tirar a parte onde optamos as amostras e para ficar com a parte que apenas tem as proteínas que correram nesse gel tão aqui se Vocês conseguem enxergar o marcador colocar esse papel filtro atrás que ficar melhor e aqui Vocês conseguem enxergar alguns marcadores da corrida do gel que se separaram eu vou passar

o gel para o meu papel filtro e com cuidado para não quebrar o gel porque ele é bem sensível bem fininho pronto aí eu tiro as bolhas de ar que ficam entre o papel filtro e o gel e para garantir que é corrente passe de forma uniforme A corrente elétrica passa de forma uniforme E aí eu tenho então meu gel aqui no meu papel filtro e eu vou colocar esse gel na parte preta do aparato do aparato de transferência E mais uma vez eu vou garantir que não tem nenhuma bolha de ar entre o papel

filtro e o gel bom então eu pego a membrana de nitrocelulose coloca aqui no meu tampão de transferência que isso é um processo de transferência molhada que não no qual nós utilizamos um tampão de transferência então a membrana vai encima do gel eu e mais uma vez eu vou garantir então que não tenha bolhas de ar agora entre o gel e a membrana E aí eu coloco outro papel filtro em cima agora da membrana mais uma vez retirar as bolhas de ar agora entre o papel filtro é membrana vou colocar outra esponjinha em cima e

fechar o aparato com cuidado vou colocar dentro do ângulo do aparato da culpa de transferência ou preto para o lado preto isso é muito importante para que o jaupaci as proteínas passem do gel para membrana porque se eu colocar o contrário as proteínas vão passar do gel para o papel depois de preparar todos os aparatos de transferência e colocá-los dentro da Cuba eu vou encher essa Cuba com um tampão de transferência que contém metanol Vinte por cento de metanol Esse é o protocolo do nosso laboratório em seguida eu vou colocar dois cubinhos de gelo dentro

para que essa esse processo não Skin o vento e o gel de reta ou se perca proteínas nesse processo uma vez que passa corrente elétrica ocorre um processo de aquecimento desse tampão eu vou colocar a parte preta da tampa do lado preto para sempre garantir que correntinha passado negativo para o positivo e eu faço o processo de transferência dentro da geladeira aí eu programo para 104 volts a minha amperagem é varia durante 90 minutos Coloca ele para correr e aqui se vocês observarem começa a sair umas bolinhas de ar do lado preto que seria o

k tudo lado negativo aqui da nossa culpa de transferência e do lado vermelho não sai nenhuma bolinha Por que não tá passando corrente porque a gente vai do negativo para o positivo bom então finalizado com uma E aí E aí E aí e o meu Jão que antes estava na parte preta né ficou aqui em cima da membrana vou tirar eles e não é possível ver as proteínas foram transferidas para membrana a nova deixado que confiro se de fato as proteínas estão aqui ó e mostrar pra vocês então a marca dos proteínas o que como

ela se apresentam aqui nesse na minha ele essas manchinhas Então as proteínas eu vou deixar uma foto melhor do Poço para você ver eu sei que realmente as proteínas que eles estavam no Gel agora tava querendo lembrando depois que eu faço um só eu lavo esse outro só um corante Mesmo com tempo ele vai me levar melhor acho que dá uma imagem melhor eu lavo com uma solução permite uma solução Basalto simples ai ai e essa esse Rosinha sai então todo esse lavando aqui e eu vou até uma membrana limpa de novo e há 20

minutos 30 minutos que nós lavamos essa membrana iremos totalmente corante trás e o leite ou pode ter Albumina que a proteína e ela como evitar é de interesse bom então e é com leite durante uma hora na meditação e Bom vamos lá como que eu tô nesse processo para reconhecer a proteína específica que eu quero Como que o anticorpo faz isso então lá na minha a amostra de música e foi o que eu te liguei lá no hospital ela vai vender diversos tipos de proteína Então lá vai ter beta-actina a Tu vai querer que eu

digo nada E aí E aí Ah tá em diversos tipos de proteína lá mas eu quero só eu posso saber quanto desperta que tina tem nas para mim amor tá E aí e tomando a minha mostra vai ter um E como que o meu anticorpo Se liga só abacate E aí [Música] e ele não vai reconhecer E aí E então como eu ia dizendo antes de ser interrompida pelo Meu experimento é oi oi é né n e ele não vai poder conhecer a minha tá porque se aparecer um ante pé da Quina tá E hoje

eu escrevo devagar o BH E aí Bom dia E aí E aí E aí e onde esses anticorpos são produzidos eles são produzidos em animais tá então eles E aí E aí bom então produzidos de Matos o cabra e eles têm algumas outras espécies mas as pessoas mais conheço uma vez o conhecido então meu anjo primário se eu consigo a minha proteínas de interesse como eu estou primários E para isso ainda não tá eu vou precisar encubar Eu só fiquei com dado que você realmente Quanto tempo demora essa ligação primária para acontecer do meu anjo

porque a minha proteína Depende se eu quiser a medida da geladeira quatro grau a 4° a isso vai demorar aproximadamente 12 horas a gente sempre deixe de um Oi tá de vida e é isso aí O que é mais quentinho é isso pode demorar cerca de quatro horas eu vou fazer dentro da geladeira né vou deixar e o dia para o processo o meu anticorpo primário e a passar as minhas 12 horas eu vou tirar a minha membrana é desse tipo primário vou lavar ela de novo negócio do som basal para tirar Ofício e eu

Vou empurrar Essa sou testar lembrando em uma solução diante por você cuidar vou mandar ele vai conseguir no antes espera tá então por exemplo o primário de beta-actina foi produzido e Coelho o meu anticorpo secundário tem que ter um Antico ele tá e o que que tem esse anticorpo secundário ligado Aonde estamos secundárias Isso inclui off que ele que vá a reação com uma substância aqui e me ilumina tem para que a gente visualize as proteínas ou que a gente chama de plantas tá então lá na minha e da parte que é na parte do

meu anticorpo secundário então Oi meu anjo foi primário ligado a minha proteína E aí E aí Ah mas não tem ligação o capitão o meu anjo corpo secundário é E então como eu disse o meu primário foi produzido em escolher então eu vou lá e coloco secundária frente com ele G1 E aí Ah tá E aí E aí E aí oi oi E aí e desligar o E aí E aí vai lá e vai depois E aí em pouco tempo então vai ficar uma de corpo secundária cerca de uma hora uma hora que eu ia

depende do protocolo do laboratório tá então aqui no meu nome é o próximo de laboratório A gente deixa 60 minutos na temperatura ambiente mês bom então passado esse tempo lá E aí bom então vamos cozinhar aqui o cozinheiro E aí [Música] E aí e quando eu colocar uma solução quimiluminescente que nós conhecer como esse L ta o luminol E aí E aí o que isso imita luta é pouco revelar uma foto como fazer um raio-x por exemplo e os produtos ela consegui em março né queimasse e eles E aí só visualizando as proteínas E aí

E aí Tá certo então como por exemplo é eu consigo dizer se tem mais ou menos que o meu a minha intervenção se eu vejo fiz meu alimento a minha droga que eu utilizei lá naquele experimento ela foi aumentou o Diminuir a quantidade daquela proteína mais tempo pela força com que esta semana cês vão estar com a gente lá embaixo e por exemplo se eu tiver assim mais forte e mais marquinha aqui E aí bom então aqui tivesse E aí e aqui então pra finalizar eu já deixei na minha solução de corpo todo secundário público

uma hora já lavei ela minha membrana que agora eu vou colocar aqui do luminol que é feito dessas duas substâncias aqui na minha lembrança E aí E aí bom então eu coloco as minhas membranas aqui dentro dessa máquina que nós chamamos de foto documentadora e verificamos se tá alinhado fechamos a nossa máquina nós iniciamos o processo de revelação bom então é a máquina vai contar o tempo e vai revelar as proteínas Essas são as gurias do adote me apesar de trabalhoso é uma técnica interessante é importante é em termos laboratoriais porque ele permite que nós

só somos a quantificação é diferente porque amostra seja ela células sejam ela amostras de diferentes tecidos músculo cérebro o fígado de animais ou até mesmo amostra humana então gente ficar alguma dúvida a respeito do processo de Western blot ao longo dos anos Vocês ainda vão ver bastante a presença dessa técnica em artigo científico e de determinadas áreas são é só procurar gente