Olá a todos, meu nome é Pedro, você provavelmente já me conhece, pois esse é o segundo vídeo. Se você não me conhece, recomendo que volte para o primeiro e assista ele. E nesse segundo vídeo nós iremos falar um pouquinho sobre a inspeção gênica.
O título dele tá detecção de metanol, mas na verdade é um vídeo sobre expressão gênica em microorganismos, mais especificamente em bactérias. E mais para frente, logo depois desse vídeo, vocês vão fazer uma atividade H5P sobre expressão gênica em eucariotos, mas tudo vai ser bem explicado no seu devido tempo. Pois bem, quando falamos de expressão gênica, nós, primeiro de tudo, temos que pensar no dogma central da biologia, que não é nenhum dogma, ele já foi alterado diversas vezes, que diz que o DNA se replica em si mesmo.
E esse DNA ele contém informações no formato de genes. Essas informações são transcritas. Na transcrição, elas geram o RNA.
Esse RNA ele pode passar tanto por autorreplicação quanto por transcrição reversa. No entanto, essas são coisas mais recentes. Vamos ignorá-las.
E o RNA ele é um intermediário no dogma central, pelo menos, e ele é pode ser convertido em proteína através do processo de tradução. Esse dogma ele ilustra muito bem os princípios básicos da expressão gênica, onde um gene é transcrito para um RNA mensageiro, e esse RNA mensageiro, por sua vez, é traduzido por um ribossomo em uma proteína. Pois bem, quando falamos sobre tudo isso, vem uma pergunta muito interessante, que é como isso funciona.
Bom, o genão humano tem mais de 20. 000 genes. Uma bactéria, um ser muito pequenininho, possui cerca de 6.
000. E uma questão muito importante que surge naturalmente disso tudo é: todos os genes são expressos ao mesmo tempo. Na verdade, isso não é nenhuma questão, porque quando a gente pensa um pouquinho sobre isso, a gente já pensa sobre o quão absurdo isso seria.
E a grande pergunta é: se eles não são expressos ao mesmo tempo, como que funciona isso, né? Como que eles se decidem se você vai expressar uma coisa em vez da outra? Como que, por exemplo, uma bactéria sabe quais genes de metabolismo ela expressa, o que que regula esse tipo de coisa?
Pois bem, eh, foi uma pergunta sobre isso. Foi, foi bem, foi perguntando sobre isso, que os primeiros estudos sobre a expressão gênica surgiram. Os primeiros estudos foram realizados em ecoli, especificamente com o metabolismo de lactose e ocorreram na década de 60.
Pois bem, porque a cole, né? E é uma bactéria, ela cresce muito rápido, ela cresce muito fácil, basicamente diversos substratos você consegue crescer e ela tem uma genética muito tranquila, por assim dizer. Existem bactérias muito difíceis de se trabalhar, geneticamente falando, mas é col não é uma delas.
E tudo isso junto com ser uma bactéria comum e que se tornou padrão para ciência, para microbiologia. fez com que ela fosse um modelo natural para estudos envolvendo expressão gênica, assim como ecol serviu como modelo natural para bactérias gran negativas, na verdade para bactérias no geral e bactérias grampositivas que funcionam um pouquinho diferente, você tem bacilos subtiles, que também surgiu mais ou menos mesmo tempo como modelo. É, o que eu quero trazer especificamente nesse vídeo sobre expressão gênica é eu recomendo a todos que tiverem interesse nessa área.
Caso você tenha muito interesse que entender como as coisas foram descobertas, o que eu pessoalmente acho uma coisa muito interessante, recomendo buscar o artigo de Jacob Manu, que foi foram os pesquisadores que descreveram todo o comportamento do Operão da Lactose e como que ele funciona, como que é sua regulação. E vamos ver mais para frente no que que isso acabou gerando no futuro, né? no futuro que ainda hoje é passado, mas que são as implicações da pesquisa de Jacomonop.
Pois bem, vou falar um pouquinho sobre Anotom erum. Eu achei essas figuras muito interessantes no site da Academy. É um site muito bom para quem tem interesse em aprender uma infinidade.
Depois eles tem muitos assuntos com muitas ilustrações legais, muitas videoaulas ótimas. E a figura está em inglês, mas vamos traduzir aqui. Eh, quando a gente fala de uma bactéria, na dentro da bactéria você tem um cromossomo.
Esse cromossomo, geralmente na, não posso falar na maioria, mas em grande parte das bactérias que a gente trabalha, que são como laboratórios, é um cromossomo circular, ou seja, as suas duas pontas são ligadas. E em bactérias é muito comum nós temos operons. Operons são sequências de DNA contendo vários genes que são transcritas pela RNA polimerase em um único MRNA, ou seja, diversos genes são transcritos em um único RNA mensageiro.
E depois esse único RNA mensageiro vai ser traduzido por diversos para formar diversas proteínas em um único RNA. Isso é muito comum em bactérias, mas não é nada comum em eucariotos. Então isso é é bem interessante, é uma diferença bem fundamental entre os dois organismos, inclusive.
Mas, ok, agora que vocês entenderam que é um ópero, vamos falar um pouquinho sobre como que ele pode ser regulado. Classicamente, uma maneira muito tranquila de um ser regulado é para que a RNA polimerase transcreva um ópero para que ela transforme uma sequência de RNA em uma sequência de DNA, perdão, em uma sequência de RNA mensageiro, ela precisa reconhecer um promotor. Esse promotor ele sempre vai estar antes do gêno, antes do primeiro gênio que deve ser transcrito, pois é ele que é reconhecido pela RNA polimerase.
a enzima que faz a síntese do RNA mensageiro e dá origem ao MRNA. O MRNA tá aqui representado como esse risco em cinza aqui embaixo na figura. Pois bem, caso esse essa região promotora esteja de alguma maneira bloqueada, tipo assim, tem alguma coisa ligada ali, a polimerose já não vai ser capaz de reconhecê-la e fazer a transcrição dos genes.
Uma dessas coisas que podem se ligar à região promotora de um de um gênio, de um ópero, é chamado de repressor, proteína repressora. E esse repressor, ele se liga não no promotor como um todo, mas numa região específica denominada operador. Então nós temos a reunião polimeras, aqui está representado em roxo.
Ela tenta entrar no sítio do promotor, no entanto, ela não consegue fazer a transcrição, porque dentro do promotor você tem um operador e nesse operador o repressor, a proteína repressora que tá em laranja, tá ligada. E essa proteína laranja impede que a RNA polimerase se ligue e faça a transcrição do ópero. Essa é uma arquitetura muito comum e o repressor ele não pode só bloquear, ele também tem que ser de alguma maneira soltar da do DNA para permitir que a transcrição seja feita.
E agora a gente fal tá falando normalmente em regulação, porque como você controla se o repressor tá ligado ou desligado, o DNA vai dizer que genes vão ser transcritos ou não. Inclusive, uma das maneiras pelos quais um repressor pode ser controlado pode deixar de se ligar ao DNA eh através da ligação de uma pequena molécula. O caso que temos aqui, o repressor está em verde.
Quando o repressor está ativo, ele se liga ao DNA. No entanto, quando você tem a presença de uma pequena molécula, ela se liga em uma cavidade do repressor, essa ligação altera a sua conformação, altera a sua estrutura tridimensional. Geralmente não é uma alteração gigantesca, mas é uma alteração que pode ou cessar ou diminuir significativamente o quanto que esse repressor tenha de afinidade pelo DNA.
Então, quando essa pequena molécula é adicionada, o repressor entra no seu estado off e aqui no exemplo, ele perde totalmente a sua capacidade de se ligar. E se o repressor não está ligado e o está desreprimido, então ele está sendo transcrito e seus genes estão sendo, por sua vez, traduzidos e produzindo a proteína que esse repressor estava regulando, estava reprimindo. Pois bem, agora que vocês conhecem a anatomia padrão de um ópero, vamos falar sobre um caso mais específico, foi exatamente o caso estudado por Jacó Monua na década de 60, que rendeu um novo para eles, que é a regulação do operonc.
Operon lac é o envolvido na met no metabolismo da lactose em xerifiche ecolle em ecolle e nós temos algumas coisas importantes aqui. Pois bem, em laranja mais escuro, nós temos o promotor, que é a região onde a rinha polimer se liga. À direita dele, nós temos um sítio de um operador, onde um repressor que pode bloquear rinha a polimerase se liga.
E à direita do nosso operador nós temos os genes laque Z, laque Y e laque A. Cada um desses genes tem uma função diferente dentro da célula. O laquiz, ele é uma beta galactos, ou seja, ele cliva a lactose.
O laquip é uma permease, ou seja, ele permite entrada de lactose dentro da célula. Ele é uma bomba que fica lá na membrana que permite a entrada da lactose de fora para dentro da bactéria. E nós temos laquear, que tem uma função um pouquinho menos definida, mas que não é essencial pro metabolismo da lactose.
Pois bem, além dessa parte envolvendo envolvendo promotor, operador e os genes, mas pouco à esquerda nós temos o capsite. O CAP, eu não vou entrar em detalh sobre ele aqui, mas basicamente ele é uma proteína que promove a ligação da RNA polimerase, ou seja, ele é uma espécie de ativador da transcrição, mas como a regulação dele é um pouquinho mais complexa e depende de um segundo mensageiro dentro da célula que é o CP, eu não vou entrar em detalhes sobre como que ele funciona, porque foge um pouquinho do nosso escopo. Pois bem, quando falamos do Operon Lac de maneira simplificada, considerando apenas a ação do repressor sobre o operador, quando a lactose está ausente, o repressor laciga fortemente ao operador, impedindo que a RNA polimerase faça a transcrição do genes do ópero.
Então, não tem lactose, não tem transcrição. Até porque, qual a necessidade da bactéria produzir as proteínas de metabolização da lactose quando não existe lactose? Agora, quando você tem lactose, as coisas mudam, porque a lactose ela, em uma forma específica que é a lactose, ela se liga ao repressor.
O repressor ligado à lactose perde afinidade pelo DNA, pela sequência operadora. ele se solta do DNA, permitindo a transcrição, permitindo o acesso da RNA polimerase ao ópero e sua respectiva transcrição. Você pode estar pensando, pensei agora que acho que vai ser interessante falar sobre isso.
Você pode estar pensando que não só a lactose tem que estar presente, mas a bactéria também tem que ter necessidade de metabolizar a lactose, porque se a lactose tá presente, mas existe uma fonte de carbono preferencial, como é o caso da glicose, que é um açúcar mais simples, e açúcares mais simples são preferenciais para bactérias, como alimento primário, alimento não, como metabólico primário. É, a gente pensa por que que ela ativaria o operace se não tem necessidade dela metabolizar a lactose porque ela tem glicose no meio. E é justamente aí que entra a função do capsite.
Mas eu não vou entrar em detalhes. Caso você queira, eu vou deixar com material suplementar um material sobre o oper onde você pode ver com mais detalhes como que o capsite funciona. ou caso você queira entrar mais ainda mais a fundo, recomendo que dê uma olhada em qualquer livro de bioquímica, seja no Voit ou no princípio da bioquímica de Deniger, onde você vai ter uma descrição muito bem feita sobre como que esse funciona, como que é a regulação desse OK?
O ponto onde eu queria chegar é que o conhecimento do funcionamento da expressão gênica permitiu o desenvolvimento de novas tecnologias para controlar a produção de proteínas em microorganismos. Porque o que que foi pensado? Beleza?
Se nós temos uma maneira tipo natural em que uma proteína produzida quando você tem lactose no meio, pensa, vamos tirar um pouquinho a ideia dos genes laquela que aqui pr laquear e vamos pensar, será que se a gente pegar uma sequência de outro gene e colocar no lugar deles nesse mesmo ópero, será que se adicionar lactose esse neurogênio não vai ser produzido também? Então, a gente tem uma maneira de controlar a produção de proteínas e é justamente isso. E esse conhecimento foi utilizado pro desenvolvimento da biotecnologia e isso culminou no processo de expressão heterólogo de proteínas.
Defção heteróloga utilizando vetores de expressão. Vetores são plasmídios, plasmídio. Vetores podem ser plasmídios, existem outros tipos de vetores, mas eu também não vou entrar nisso.
E comumente vetores são plasmídios em bactérias. Plasmídios são unidades cromossomais de DNA, ou seja, não estão no cromossomo. Eles geralmente possuem um marcador de seleção para que a bactéria seja obrigada a mantê-lo dentro da célula.
Os plasmídeos sintéticos, que é o caso daqueles que nós lidamos, eles possuem marcadores seleções que geralmente são genes de resência antibióticos. Então, quando nós estamos lidando com bactérias plasmídios, elas sempre são cultivadas em antibióticos para que caso elas não tenham plasmído, elas não sejam capazes de sobreviver. Pois bem, qual é a ideia aqui?
Eu adicionei essa figura e adicionei uma pequena legenda. Como nós poderemos ver no plasmídio tem uma região em vermelho, que é o marcador de seleção, que no caso seria um G de resistência antibiótico qualquer. Nós temos o a região verde que é o promotor lac que ele foi copiado exatamente começar no cromossomo, mas em um plasmídio.
Em azul nós temos um gene alvo que nesse caso, como exemplo é o gênio da insulina. O que acontece é que caso você efetue uma clonagem molecular, que é esse procedimento onde você digere um plasmídio com enzima de restrição e também o seu gêno com enzima de restrição e usa uma DNA ligase, que é uma enzima capaz de juntar DNA e ligar ele, você consegue inserir o gênio da insulina nesse plasmídio logo depois do promotor LC. E se ele tá inserido logo depois do promotor LC, o promotor LC contém um operador lac, a gente pode a gente pode supor que na ausência de lactose não vai acontecer nada, mas quando adicionar lactose o gênio da insulina vai começar a ser expresso, vai começar a ser transcrito e o transcrito, por sua vez, vai ser traduzido.
Exatamente o que acontece. Primeiro, nós transformamos aquela reação de ligação com a liase em bactérias. Essas bactérias passam um processo de transformação por choque térmico, que é um processo bem comum para transformar bactérias.
como transformação, quero dizer pegar um plasmídio fechado e ser de bactéria. E não são todas. Esse processo não é 100% eficiente.
No entanto, que 10%, que 1%, que 0. % das bactérias aceitem o plasmídio. Eh, eu falo 0.
1, eu posso falar bem menos 0. 1, porque bactérias a gente tá falando de 10 a 8 células por ml. São muita co é muita coisa.
Então, mesmo que poucas aceitem o plasmídio, eh, quando eu plaquei uma placa cont antibiótico, iri se elestinar apenas aquelas que aceitaram e cada bactéria que aceitou vai ser uma colônia individual. Essa colônia vai se multiplicar até ficar visível. Beleza?
Tem uma bactéria com meoplasmídia. Meoplasmíde, eu tenho gen da insulina sobre controle de um promotor, um promotor que é o promotor lá, que induziv lactose. Agora, se eu pego a bactéria dessa placa que já tem um antibiótico, passo pra mente de cultura líquido, contém um antibiótico e adiciono lactose ao meio, esse operão lac que estava reprimido pelo repressor lac, ele vai ser desprimido.
E o gene, que é no caso, é o gene que eu gostaria, mas é o gene de interesse, no caso aqui é o gene da insulina. Ele vai ser transcrito loucamente, ele vai ser traduzido loucamente e ele será e por fim traduzido como proteína. No caso aqui é a insulina, que é um poliptídeo.
Nós teremos a produção proteica através de um promotor usando expressão heteróloga, porque insulina não é uma proteína de ecolóle. E eu gostaria de trazer uma pequena reflexão, que é uma vez a gente consegue fazer com que utilizando lactose produza outras proteínas que não proteínas naturais da célula. Será que se a gente tem outras bactérias que sentem diferentes estímulos, a gente não consegue fazer a mesma coisa?
Eh, se vocês viram aquela primeiro vídeo, vocês viram que no final eu utilizei uma célula de estafilococos fluorescentes, células de estafilococos fluorescentes. Para isso fiz uma coisa muito parecida. Eu peguei um vetor, adicionei um indutor e nesse vetor eu tinha um gên de FP e esse promotor quando adicionava indutor deixava as bactérias produzirem GFP e elas ficavam verdes.
Então a gente começa a pensar sobre uma série de coisas, por exemplo, aplicações sensores. Será que existe alguma bactéria que é capaz de metabolizar metanol? E se ela é capaz de metabolizar metanol, será que a expressão gênica dela responde ao metanol?
Eu adianto para vocês até existem bactérias, no entanto, o que é mais estudado não é uma bactéria, mas sim uma levedura. E por ser uma levedura, ela é um eucarioto. Eucariot tem algumas diferenças processos que serão explicadas na aula, na aula prática, né, que é o H5P.
E outra coisa que eu gostaria que vocês pensassem é como podemos aproveitar do processo naturaisão gênicas em microorganismos para desenvolver sensores? E eu acho isso é muito interessante. Pensem sobre isso e assim que vocês se sentirem preparados, vão até o H5P.
Eu acredito que com esse vídeo de agora, com esse segundo vídeo, principalmente, vocês estão mais do que prontos para enfrentar aquela atividade. Muito obrigado pela atenção e até aula prática e até o nosso encontro. Ciao.
Ciao.
